Myelodysplastic syndromes (MDS) in evolution to acute myeloid leukaemia (AML)Biomarkers and new therapeutic targets by next generation sequencing

Resumen

Las Neoplasias mieloides (NM) son un grupo de enfermedades clonales que afectan a las células madre hematopoyéticas y que son el resultado de alteraciones genéticas y epigenéticas que interfieren en procesos clave como autorenovación, proliferación y diferenciación. Las NM tienen una incidencia anual de 8,6 casos por cada 100,000 habitantes y comprenden estados crónicos como Síndromes Mielodisplásicos (SMD) y estados agudos como la Leucemia Mieloide Aguda (LMA). Nos propusimos investigar nuevos biomarcadores genéticos que nos ayudaran a predecir la transformación de SMD a LMA mediante la utilización de técnicas de secuenciación de nueva generación (NGS). Primero, evaluamos la eficacia para detectar variantes de nuestro panel pan mieloide (PMP) de diseño propio. Comparamos las características técnicas de PMP y 3 paneles comerciales. Nuestro panel detecto el mayor numero de variantes clínicamente relevantes. Segundo, estudiamos la capacidad de PMP para detectar biomarcadores de transformación de SMD a LMA. Los patrones mutacionales detectados en nuestro estudio ya habían sido reportados en la literatura. Tercero, expandimos el estudio ampliando el numero de pacientes y el numero de genes a estudiar. Hicimos el exoma completo (WES) de 16 pacientes con SMD que transformaron a LMA, y encontramos mutaciones recurrentes en genes que apenas se han descrito en neoplasias hematológicas. De especial interés, fueron las mutaciones en el gen PRSS3, detectadas solo en casos de LMA; este gen se ha relacionado con progresión de la enfermedad y metástasis en otros tipos de cáncer. Cuarto, comparamos la eficacia de la detección de variantes mediante WES y PMP. Cada técnica detecto diferente numero de variantes. La discordancia entre variantes se debió, al diseño del panel, a la profundidad de secuenciación, y a la naturaleza germinal o somática de las variantes. Esto es importante pues algunas variantes germinales predisponen a desarrollar NM. Además, con PMP se informan variantes como somáticas que podrían ser de naturaleza germinal. Quinto, diseñamos una estrategia para la identificación de variantes sospechosas de ser germinales utilizando datos del PMP. Sobre los datos de secuenciación de 299 pacientes se aplicaron 2 filtros: Genes reportados en la literatura como relacionados con la predisposición a desarrollar NM, frecuencia alélica, patrones mutacionales y análisis de se los datos de secuenciación durante el seguimiento de la enfermedad. Confirmamos que es necesario secuenciar tejidos no mieloides para finalmente discriminar la naturaleza de las variantes. Tres de los cinco tejidos no mieloides probados, ayudaron a discriminar la naturaleza de las variantes: fibroblastos de piel, folículos pilosos y células T CD3+. Sexto, Como sabemos los biomarcadores pueden ser genéticos o epigéneticos; por lo que las zonas no codificantes son también importantes, en particular nos centramos en los miRNAs, para estudiar si podrían tener un papel en la progresión de SMD a LMA. Para ello secuenciamos exomas y UTRs, de 16 casos. No se identificaron mutaciones en genes de miARN, pero si en miRNA binding sites, aunque ninguna fue encontrada en genes involucrados en neoplasias hematológicas. Combinando los datos de ambos bioinformáticos, y la recurrencia de mutaciones en miRNA binding site en otros genes, realizamos estudios funcionales in silico de 23 genes con RNAup SERVER, y estudios in vitro de 5 genes que presentaron un cambio en la energía libre de unión cuando la mutación estaba presente, en comparación con el wild type. Tras realizar ensayos de luciferasa, observamos que el gen KIF5C mostraba un aumento estadísticamente significativo en la actividad de la luciferasa cuando el miRNA binding site estaba mutado al tratarlo con miR-1911-5p, en comparación con el wild type. Confirmando el efecto directo del miRNA en la regulación del gen KIF5C, y que la mutación disrumpe la función del miRNA.