Aplicaciones traslacionales en neoplasias mieloides de la secuenciación de nueva generación de ARNnuevas dianas de letalidad sintética e inmunoterapia

Resumen

Antecedentes: Los avances terapéuticos y en la supervivencia en neoplasias linfoides durante las dos últimas décadas no se han reproducido en el entorno de las enfermedades malignas mieloides, en las que existe una necesidad urgente de nuevas dianas terapéuticas. A pesar de la ausencia de mutaciones en los genes de la maquinaria de reparación del ADN en neoplasias mieloides, la llegada de la secuenciación de nueva generación y los descubrimientos de defectos epigenéticos y del espliceosoma en leucemia mielomonocítica crónica (LMMC) nos impulsó, en el primer capítulo de este trabajo, a revisar el papel patogénico de los genes implicados en la respuesta a las lesiones en el ADN. En el segundo capítulo, nos centramos en los antígenos testiculares tumorales (ATTs), un grupo de moléculas cuya expresión se silencia por hipermetilación en las células somáticas de individuos sanos. Sin embargo, las células tumorales re-expresan algunos de estos ATTs, de manera específica para cada tumor, con propiedades inmunogénicas. Incluso cuando se re-expresan, estas moléculas muestras niveles bajos de transcritos, y el uso del RNA-seq global puede no ser lo suficientemente sensible para caracterizarlos. Para este tipo de estudios, el RNA-seq dirigido ha demostrado ser más preciso. Objetivos: Aprovechar los avances en los experimentos de RNA-seq para identificar nuevas moléculas que puedan ser dianas en LMMC y enfermedades relacionadas, centrándonos en la estrategia de la letalidad sintética para los genes de la reparación del ADN, y en los cambios de expresión génica de los ATTs tras tratamiento con azacitidina para dianas de inmunoterapia. Métodos: Estudiamos la desregulación de los genes de reparación de ADN mediante RNA-seq global en médula ósea de 27 pacientes de LMMC y 9 controles (cohorte de descubrimiento). Validamos los candidatos diferencialmente expresados en la fracción CD34+ de médula ósea de pacientes con LMMC, y en una cohorte independiente de 74 LMMC, caracterizadas a nivel mutacional por secuenciación dirigida de ADN. En segundo lugar, diseñamos un panel dirigido a 210 ATTs para estudiarlos por RNA-seq al diagnóstico y tras un ciclo de azacitidina en 19 pacientes, validando a nivel proteico el comportamiento de nuestros principales candidatos y comparando los resultados con RNA-seq global procedente de 11 pacientes al diagnóstico y tras tratamiento Resultados: Encontramos una infra-expresión de BAP1 y PARP1 específica de LMMC comparada con otras enfermedades relacionadas. Los casos con mutaciones en reguladores de la cromatina mostraron los niveles más bajos de BAP1. Validamos una sobre-expresión significativa de dos genes clave en mantener la fidelidad de la reparación de roturas de doble cadena, CDKN1A y ERCC1, independiente de la metilación del promotor y asociado a quimioresistencia. Además, los pacientes portadores de mutaciones en el componente del espliceosoma SRSF2, presentaban numerosos eventos de splicing aberrante en los genes de reparación de ADN, más frecuentes en los genes de la vía de reparación de cadena única. Por otra parte, realizamos RNA-seq dirigido a 210 ATTs en muestras antes y después del primer ciclo de azacitidina (día +28) en 19 pacientes con SMD (n=13) y LMMC (n=6). Encontramos que 137 de los 210 ATTs mostraban una expresión significativa (CPM>1) al diagnóstico. Algunos de los ATTs que no se expresaban antes del tratamiento mostraron una re-expresión significativa tras azacitidina; destacando ADAM29 dentro de estos ATTs expresados de novo tras tratamiento hipometilante. Además, TFDP3 y DDX53, ambos en el cromosoma X, emergen como candidatos principales a dianas terapéuticas al cumplir dos condiciones: i) aumento significativo de la expresión tras un ciclo de azacitidina en aquellos pacientes que alcanzaron respuesta completa tras 4 o 6 ciclos, y ii) dinámica paralela a nivel proteico. Con lo disponibilidad de datos del transcriptoma completo de 11 de estos pacientes antes y después de un ciclo de azacitidina, comparamos los datos de ambas técnicas. Identificamos 203 ATTs comunes en los dos experimentos. De ellos, 181 se expresaban antes y/o después del primer ciclo de azacitidina en el experimento dirigido y solo 53 en el experimento del transcriptoma global. Conclusiones: Nuestros resultados destacan dianas potenciales, seleccionadas con criterios clínico-biológicos y usando nuevas técnicas de secuenciación, en este grupo de enfermedades que, actualmente, presentan escasas opciones para ser tratadas.