Serina 284 como regulador de la dimerización y de la localización celular de ERK2

Resumen

1. INTRODUCCIÓN La ruta de señalización mediada por las MAP quinasas ERK1 y 2 desempeña un papel esencial en el control de la proliferación, diferenciación y supervivencia celular, en condiciones fisiológicas. Esta ruta es activada en respuesta a una gran variedad de estímulos mitogénicos, como por ejemplo el factor de crecimiento EGF. La unión de EGF al receptor de membrana RTK, con actividad tirosina quinasa, conlleva la activación de RAS. Las proteínas RAS unen nucleótidos de guanina y actúan como interruptores moleculares. Una vez activada, RAS media la activación de RAF (MAPKKK), la cual desencadena el mecanismo de activación secuencial, por fosforilación, de MEK1/2 (MAPKK) y finalmente de ERK1/2 (MAPK), que se fosforila en treonina 185 y tirosina 187. Las proteínas ERK1/2, una vez activadas en el citoplasma, dimerizan y regulan la activación de un gran número de sustratos, citoplasmáticos y nucleares (más de 400). Las señales de ERK están reguladas por varios tipos de proteínas reguladoras, como por ejemplo las proteínas "scaffold". Dichas proteínas ensamblan a los distintos componentes de la cascada en un complejo multi-enzimático, mediante el cual regulan y afinan la intensidad, amplitud y duración de las señales. Además, estas proteínas tienen un papel importante en la regulación espacio-temporal de la señalización de ERK. Estudios previos en nuestro laboratorio han demostrado que las proteínas scaffold regulan de manera sitio-específica la activación de la cascada de señalización MAP quinasa, uniéndose a dímeros de ERK. De esta forma la dimerización de ERK sería un punto crítico para la activación de los sustratos citoplasmáticos y su retención en el citoplasma. Por otro lado, se ha descrito el mecanismo de translocación de ERK al núcleo. Según este modelo, ERK una vez fosforilada en dos serinas (motivo SPS) entra al núcleo a través de los poros nucleares unido a la proteína Importina 7. Un gran número de estudios demuestran incuestionablemente la implicación de la ruta de señalización RAS-ERK en la aparición y progresión de muchos tumores. Aproximadamente el 40% de los tumores humanos portan mutaciones activadoras en algún miembro de la cascada de señalización RAS-ERK, en particular RAS G12V y B-RAF V600E. En melanoma, esta cifra es aún más alta, con un 15-20% de melanomas que presentan mutaciones N-RAS, mientras que el oncogén B-RAF aparece mutado en el 50-60% de los casos. Consecuentemente, en los últimos años, tanto la investigación básica como la industria farmacéutica, han dedicado un enorme esfuerzo en la búsqueda y desarrollo de fármacos destinados a bloquear las señales oncogénicas que fluyen a través de la ruta RAS-ERK. Los inhibidores de las quinasas B-RAF y MEK se destacan como agentes terapéuticos muy prometedores para el tratamiento del melanoma. Los inhibidores de RAF, como el Vemurafenib (PLX4032), han mostrado una espectacular eficacia clínica en melanomas con mutaciones en BRAF V600E. Además, se han testado, con mucho éxito clínico, los inhibidores alostéricos de MEK1/2, como el trametinib (GSK 1120212) y se ha visto que son más efectivos en pacientes con mutaciones B-RAF. En ambos casos, la eficacia terapéutica es proporcional al grado de supresión de actividad de ERK. Si bien estos fármacos logran importantes remisiones en pacientes con melanoma (B-RAF V600E), la respuesta es muy variable y las remisiones completas son raras. De hecho, la mejoría es breve y los pacientes tratados con dichos inhibidores desarrollan resistencia, con lo que la enfermedad acaba progresando fatalmente. En melanoma, los mecanismos de resistencia por sí solos conllevan una reactivación aberrante de la señalización de ERK. Por lo tanto, numerosos estudios se están centrando en la inhibición de la activación de ERK o en la combinación de diferentes inhibidores que puedan actuar a distintos niveles de la cascada de señalización. En este sentido, se está revelando de especial importancia la inhibición de la interacción proteína-proteína. De esta forma, se inhibe la proteína de interés sin afectar completamente a su actividad quinasa, y además de manera compartimental. Es decir, inhibiendo ERK de manera que activen solo sustratos nucleares o citoplásmicos, se evitan los fenómenos de resistencia asociados al efecto rebote que surgiría inhibiendo completamente su actividad quinasa. Es el caso del péptido EPE, que bloqueando la unión de ERK y la IMP7 inhibe la entrada de ERK al núcleo y por lo tanto la activación de sustratos nucleares, causando apoptosis en células de melanoma con mutación B-RAF. Siguiendo la misma línea, en nuestro laboratorio, se ha demostrado la eficacia de DEL22379, un potente inhibidor, capaz de inhibir la dimerización de ERK2, sin afectar su fosforilación. DEL22379 induce apoptosis en líneas celulares de melanoma y de cáncer de colon que presentan mutaciones activadoras en B-RAF y en RAS. Además, se ha visto que el tratamiento con DEL22379 no desencadena los mecanismos de resistencia que se han descrito en otros inhibidores. En nuestro estudio hicimos la sorprendente observación de que DEL22379 no afectaba la dimerización de ERK en el modelo de embriones de pollo usado para estudiar el melanoma. A raíz de este hallazgo, nuestros análisis posteriores desvelaron que la dimerización de ERK es específica de mamíferos, lo que sugiere una diferencia evolutiva en cuanto a la dimerización de ERK se refiere. Además, se demostró como esta capacidad de dimerizar no depende del contexto celular si no que de la característica de las proteínas de ERK en las distintas especies. Sabiendo que la dimerización de ERK es esencial para la activación de sustratos citoplásmicos era muy interesantes estudiar cuáles son las diferencias de ERK en las distintas especies e intentar elucidar un poco más a fondo los mecanismos que regulan su distribución celular. 2. OBJETIVOS: - Estudiar el papel de la fosforilación de la Ser284 en la dimerización de ERK y su localización celular. - Elucidar los procesos bioquímicos y los efectos biológicos derivados de la fosforilación de ERK2 en Ser284. - Determinar la relevancia de la fosforilación de ERK2 en Ser284 en procesos de carcinogénesis y establecer su uso como un diagnóstico de prognosis en melanoma. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Para estudiar el papel de la Ser284 en la dimerización de ERK2 se generaron mutantes de ERK2 en dichos residuos, sustituyendo la serina por una prolina (S>P), un aspártico (S>D) o un glutámico (S>E). Se analizó la dimerización de estos mutantes tanto por geles nativos como por “Philipova & Witaker” PAGE. Se generó un anticuerpo fosfoespecífico frente al residuo Ser284 de ERK2 para analizar su fosforilación. Para la identificación de la quinasa responsable de la fosforilación en dicho residuo se hizo un silenciamiento de todas las Ser/Thr quinasas conocidas usando RNA de interferencia y se corroboró su efectiva actividad por ensayo quinasa in vitro. Para estudiar la localización de dicho residuo se efectuaron tanto ensayos de fraccionamiento núcleo/citoplasma como de análisis de inmunofluorescencias. Para analizar el papel de las quinasas y cómo influyen sobre la interacción de ERK con los scaffolds se realizaron ensayos de co-inmunoprecipitación, tras silenciamiento con RNAi o usando inhibidores específicos frente a la quinasa involucrada. Para estudiar las funciones bioquímicas de la Serina284 se hicieron estudios de la cinética de fosforilación de ERK en los residuos canónicos y se analizó su actividad quinasa por western blot, tras inmunoprecipitar los distinctos constructos. Para analizar la implicación biológica de la Ser284 se generaron líneas estables de MEFs ERK1-/-; ERK2 flox/flox y se analizó su actividad proliferativa por método colorimétrico. Además, mediante el uso de la tecnología de CRISPR/Cas9, se generaron ratones donde se substituyó la Ser284 por una prolina, generando un modelo animal donde ERK2 no dimeriza. Igualmente se está intentando generar un modelo de pez cebra donde ERK2 dimeriza, sustituyendo la prolina por la Ser284. Para establecer la relación entre fosforilación en Ser284 y susceptibilidad a Vemurafenib en melanoma, se analizó el patrón de p-Ser284 en distintas líneas de melanoma con mutaciones activadoras en B-RAF y N-RAS, así como se compararon los niveles de p-Ser284 en líneas de melanoma B-RAF sensibles o resistentes al tratamiento con Vemurafenib. Finalmente se analizaron los niveles de p-Ser284 en muestras de pacientes de melanoma por inmunohistoquímica. 4. RESULTADOS Y DISCUSSIÓN En este estudio hemos encontrado que la diferencia entre mamíferos y otras especies, en términos de secuencia aminoacídica, reside en el cambio de tan solo un aminoácido, habiendo una serina en aquellas especies donde ERK2 dimeriza (Ser284 en humano) y una prolina en las especies donde ERK2 no dimeriza. Por tanto, la Ser284 en ERK2 podría tener un papel importante en su dimerización. Para dilucidar este asunto, hemos generado mutantes de ERK2 cambiando dicha serina por una prolina (S>P) y dos mutantes fosfomiméticos (S>E/D). Analizando la dimerización de dichos mutantes, observamos que el mutante S>P pierde su capacidad de dimerización mientras que los fosfomiméticos dimerizan, pero solamente tras estimulación por EGF, lo cual indica que la fosforilación de este residuo es necesaria pero no suficiente. Siendo un residuo fosforilable de ERK, hemos generado un anticuerpo fosfo-específico y hemos encontrado que ERK2, únicamente en su estado dimérico, está fosforilado en dicho residuo y que, además, tanto p-Ser284, como los dímeros de ERK2, tienen localización exclusivamente citoplasmática. Por tanto, la fosforilación en Ser284 constituye un marcador inequívoco de los niveles de ERK activado en citoplasma. Además, hemos descubierto que para la dimerización se necesita que los dos monómeros de ERK estén fosforilados en Ser284. Para identificar las quinasas implicadas en la fosforilación de las Ser284 hemos hecho un screening de silenciamiento por RNAi de todas las Ser/Thr quinasa del genoma humano. Hemos identificado que tanto MEK1 como AKT1 fosforilan este residuo y que se trata de una fosforilación directa, como indican los resultados de ensayo quinasa in vitro. Este hallazgo abre el abanico de sustratos fosforilados por MEK y por AKT1, generando otro residuo más de ERK susceptible de ser fosforilado por MEK. Del mismo modo, aunque Ser284 por su secuencia consenso y ERK en sí, no es un sustrato de AKT1, nuestros resultados demuestran que AKT fosforila la Ser284, añadiendo así un nuevo sitio de fosforilación mediada por AKT. Hemos demostrado que el residuo Ser284 es importante para la localización citoplásmica de ERK en condiciones de reposo. Además, hemos comprobado que la fosforilación de la Ser284 aumenta la afinidad con proteínas scaffold, como por ejemplo KSR1. Por tanto, este residuo es un importante regulador de la distribución subcelular de ERK. El transportador que regula los niveles basales de ERK en el núcleo podría ser la Importina7, aunque no se descartan que existan otros tipos de transportadores que regulan la entrada de ERK al núcleo bajo estimulación. De hecho, como se evidencia en el análisis de microscopía (time lapse) en célula viva, la fosforilación de este residuo no está implicada en la cinética de entrada de ERK al núcleo. Hemos analizado cómo este residuo puede afectar la fosforilación de ERK en los residuos canónicos y actividad quinasa. Para ello hemos comparado la fosforilación en el motivo TEY de los distintos mutantes de ERK obteniendo que no existe una diferencia significativa entre los distintos mutantes. De la misma manera, se ha analizado la actividad quinasa de ERK analizando su capacidad de fosforilación de MBP y cómo esta depende de la presencia de la Ser284. Observamos una diferencia significativa entre el mutante que no dimeriza (S>P) y el WT, siendo más intensa la actividad del ERK WT. Además, se ha estudiado la secuencia de eventos que llevan a la dimerización de ERK y su fosforilación en TEY y en Ser284, observando que dichas fosforilaciones ocurren de forma simultánea, indicando que tanto la dimerización como la fosforilación en Ser284 ocurren al mismo tiempo. Se ha estudiado la dependencia de la fosforilación en Ser284 en términos de viabilidad celular. Los resultados muestran una reducción de la viabilidad de las células MEFs ERK2 S>P, aunque esta reducción podría ser atribuible al hecho de que dicho mutante tiene un nivel de expresión más bajo, comparado con los demás. Del mismo modo, hemos generado unos ratones modificados genéticamente, donde ERK2 no dimeriza, habiendo sustituido la Serina284 por una Prolina. Actualmente no parece que dicha sustitución esté afectando la viabilidad ni el normal desarrollo de estos ratones. Cabiendo la posibilidad de que ERK1 esté enmascarando el fenotipo que deriva de la sustitución S>P, nuestro próximo objetivo será cruzar estos ratones con ratones ERK1-/-, de manera que la única isoforma de ERK presente sea la de ERK2 S>P. Para intentar dilucidar las posibles ventajas derivadas de la dimerización de ERK, estamos intentando generar unos peces cebra donde ERK dimeriza. Estos modelos nos darán respuestas de qué ventaja tiene la dimerización de ERK, además de servir como modelo para dilucidar el papel de la dimerización en procesos de carcinogénesis, como por ejemplo el melanoma. Finalmente, sabiendo que la susceptibilidad al tratamiento con Vemurafenib de pacientes con melanoma portadores de la mutación B-RAF V600E se correlaciona con los niveles de ERK activada en citoplasma mejor que con los niveles totales de ERK fosforilada; y considerando que la fosforilación del residuo Ser284 es un marcador inequívoco de ERK fosforilada en el citoplasma, nuestro propósito ha sido dilucidar si los niveles de Ser284 fosforilada podrían establecerse como un marcador de susceptibilidad y de respuesta a Vemurafenib, más fiable que los niveles de ERK fosforilada en los residuos canónicos. Para ello hemos comparado distintas líneas celulares de melanoma, con mutaciones activadoras en B-RAF y N-RAS, así como clones celulares B-RAF tanto resistentes como sensibles al tratamiento con Vemurafenib. Hemos comprobado que la fosforilación de ERK en Ser284 es más alta en aquellas células que resultan ser más sensibles al tratamiento con el inhibidor de B-RAF, pudiendo ser un marcador de sensibilidad a este tipo de tratamiento. Con respecto a esto, hemos analizado los niveles de fosforilación de Ser284 en muestras de pacientes. Los resultados, si bien preliminares, indican que existe dicha correlación y por lo tanto este análisis de fosforilación en Ser284 podría incluirse como marcador de sensibilidad al tratamiento con Vemurafenib en aquellos pacientes de Melanoma con mutación B-RAF. De ser así, se podría hacer una estratificación precoz para identificar aquellos pacientes que sí responderán al tratamiento, frente a aquellos que serán resistentes, ahorrando inútiles efectos indeseados, tiempo y dinero. Además, este tipo de diagnóstico podría extenderse no solo a la detección de pacientes con melanoma sensibles al tratamiento, sino que también a pacientes que padecen otros tipos de tumores portadores de la mutación B-RAF. 5. CONCLUSIONES 1. La fosforilación en Ser284 es necesaria pero no suficiente para la dimerización de ERK2. 2. Ambos monómeros de ERK2 tienen que estar fosforilados en Ser284 para que ERK2 dimerice. 3. AKT1 y MEK1 son las principales quinasas responsables de fosforilar el residuo Ser284 en ERK2. 4. La fosforilación de la Ser284 de ERK2 tiene localización exclusivamente citoplásmica. 5. La fosforilación Ser284 aumenta la afinidad de ERK2 por la proteína scaffold KSR1. Por lo contrario, disminuye la afinidad para transportadores nucleares como la importina 7. 6. La sensibilidad al tratamiento con Vemurafenib de las células de melanoma portadoras de la mutación BRAF se correlacionan con unos niveles más altos de p-Ser284. Por lo tanto, los niveles de p-Ser284 podrían ser utilizados como un biomarcador de susceptibilidad al tratamiento con Vemurafenib en pacientes con melanoma portadores de BRAF mutado.