Deciphering genomescomparative genomic analysis of legume associated micromonospora

Abstract

Micromonospora es un género de bacterias Gram positivas con una amplia distribución en diversos ecosistemas (Genilloud, 2015). Este género es conocido por su gran capacidad para producir metabolitos secundarios, lo que lo convierte en un recurso biotecnológico valioso en medicina y agricultura (Carro et al., 2018; Martínez-Hidalgo et al., 2015; Trujillo et al., 2011). En los últimos años, se ha observado que Micromonospora forma una estrecha relación con tejidos vegetales. En particular, Micromonospora ha podido ser aislada de forma sistemática como endófitas en nódulos de fijación de nitrógeno en leguminosas y plantas actinorrízcas (Trujillo et al., 2015). Para intentar clarificar la diversidad del género Micromonospora en leguminosas, se han realizado múltiples estudios moleculares (BOX-PCR, ARDRA, RFLP, RAPDS) (Carro, 2009; Cerda, 2008; de la Vega, 2010; Trujillo et al., 2010). Estos estudios han revelado una alta diversidad genética en aislados de Micromonospora, dando lugar a la descripción de un número importante de nuevas especies (Carro et al., 2012, 2013; Garcia et al., 2010; Trujillo et al., 2007). Entre ellas, la más frecuentemente aislada es la especie Micromonospora saelicesensis, seguida de cerca por Micromonospora noduli, una especie muy cercana filogenéticamente con la que comparte múltiples rasgos genéticos y fisiológicos. La función ecológica de Micromonospora en relación con su planta hospedadora es aún desconocida. Sin embargo, se ha podido confirmar la presencia de estas bacterias en el interior del tejido vegetal (Trujillo et al., 2010), e incluso monitorizar el proceso de colonización del nódulo (Benito et al., 2017). Micromonospora parece interactuar de forma estrecha no solamente con la leguminosa, sino también con bacterias fijadoras de nitrógeno (rhizobia), estableciendo una relación tripartita (Benito et al., 2017). En estudios previos, se ha secuenciado y anotado el genoma de la cepa Micromonospora lupini, Lupac 08 aislada de nódulos de la planta Lupinus angustifolius (Alonso-Vega et al., 2012; Trujillo et al., 2014). Un primer análisis del genoma de esta bacteria sugirió que este microorganismo posee un alto número de genes codificantes para la producción de enzimas hidrolíticas. Se han identificado alrededor de 865 genes (9.7% del genoma) relacionados con el metabolismo de carbohidratos, de los cuales, aproximadamente 192 están relacionados con la producción de este tipo de enzimas, principalmente celulasas. La actividad de estas enzimas hidrolíticas ha sido comprobada mediante ensayos in-vitro, demostrando gran actividad. No obstante, la presencia de estas enzimas no parece perjudicar la simbiosis con la planta. El genoma de M. lupini Lupac 08 también contiene varios genes codificantes para funciones comúnmente relacionadas con las bacterias promotoras de crecimiento vegetal, como la producción de sideróforos, antibióticos y fitohormonas (Trujillo et al., 2014). Hasta 2015, se habían secuenciado y descrito solamente dos cepas de Micromonospora relacionadas con nódulos fijadores de nitrógeno, lo que supone un porcentaje ínfimo de la colección de más de 2000 cepas del género aisladas en nuestro laboratorio. Por lo tanto, gran parte del potencial ecológico, metabólico y genético de esta bacteria quedaba aún sin estudiar. Esta tesis busca ahondar en la relación beneficiosa de Micromonospora con la planta, haciendo un estudio de genómica comparativa a nivel de género para intentar dilucidar los sistemas biológicos que condicionan esta relación planta-microorganismo. Para ello, se han propuesto los siguientes objetivos específicos: 1. Creación de nuevas herramientas bioinformáticas que complementen o mejoren las capacidades de programas frecuentemente usados por la comunidad científica en la caracterización genómica bacteriana. Creación de un nuevo proceso bioinformático para la caracterización de funciones que intervienen en la relación planta-microorganismo en Micromonospora. 2. Caracterización mediante genómica comparativa de los principales rasgos genómicos que intervienen en la relación Micromonospora-planta. 3. Caracterización genómica de cepas aisladas de tejidos vegetales, cercanas a Micromonospora saelicesensis y Micromonospora noduli. las principales especies de Micromonospora encontradas en nódulos fijadores de nitrógeno de leguminosas. La presente tesis se ha dividido por tanto en tres partes, una por cada objetivo propuesto. En el primer capítulo, algunos de los programas y aplicaciones más usados en la caracterización genómica de microorganismos fueron brevemente analizados, remarcando sus puntos fuertes y débiles. Se han propuesto dos soluciones bioinformáticas diseñadas para mejorar la experiencia del usuario final en el uso de estos programas de caracterización genómica: UBCG_iTOL_maker y GGDC Output Management Assistant (GOMA). Por último, se ha propuesto un proceso basado en R, Micromonospora Plant Associated Gene tool (MicroPLAGE), cuyo objetivo es separar diferencias genómicas significativas que potencialmente intervienen en la relación entre Micromonospora y su planta huésped. Todas estas soluciones bioinformáticas han sido implementadas como scripts basados en R, que pueden ser fácilmente introducidos en procesos bioinformáticos en el futuro, cambiando unas pocas variables. El segundo capítulo se centró en el segundo objetivo: la caracterización de rasgos genómicos que intervienen en la relación planta-microorganismo en Micromonospora. Para lograr este objetivo se secuenciaron los genomas de diecisiete cepas de Micromonospora, asiladas de diferentes leguminosas (Cicer sp., Medicago sp., Lupinus sp., Ononis sp., Pisum sp. and Trifolium sp.) y tejidos vegetales (nódulos y hojas). Gracias a la inclusión de estos genomas, hemos construido una base de datos de setenta y cuatro genomas, con un número similar de genomas asociados a cepas aisladas de suelo y a cepas endófitas. Mediante el uso de genómica comparativa, y basándonos en la base de datos generada en 2018 (Levy et al., 2018) y en el proteoma de plantas huésped de Micromonospora, se han podido determinar varios rasgos genómicos que potencialmente pueden estar relacionados con la interacción Micromonospora-planta. El tercer capítulo se centró en el último objetivo. La especie M. saelicesensis ha sido aislada repetidamente de nódulos de leguminas, siendo la especie de Micromonospora más frecuentemente aislada en este tejido vegetal (Carro, 2009; Carro et al., 2012; Cerda, 2008; de la Vega, 2010; Trujillo et al., 2010, 2015). En 2016, la especie M. noduli fue descrita como una especie muy próxima a M. saelicesensis (Carro et al., 2016). Ambas especies compartían muchos rasgos, tanto genómicos como fisiológicos, y surgió la duda de si deberían ser consideradas como una sola especie. Usando diferentes aproximaciones genómicas, en el capítulo III hemos estudiado la relación taxonómica entre las especies Micromonospora saelicesensis y Micromonospora noduli para concluir que efectivamente son dos especies distintas pero muy cercanas entre sí.