Estudio de la expresión y función de genes cruciales asociados a procesos de desarrollo postembrionario durante la organogénesis de novo de agallas y células gigantes inducidas por meloidogyne spp. En arabidopsis

Resumen

La plasticidad de los mecanismos de desarrollo de las plantas en respuesta a las señales ambientales es una de las características más llamativas de la morfogénesis de las plantas. Los estímulos bióticos o abióticos a menudo promueven eventos de organogénesis en plantas que no se observan en condiciones normales de crecimiento. Los nematodos formadores de agallas (Root-knot nematodes, RKN) del género Meloidogyne parasitan múltiples especies de plantas e inducen la formación de agallas en sus raíces al alterar la maquinaria celular de la planta. Meloidogyne es un género de nematodos fitoendoparásitos que produce importantes pérdidas económicas en la agricultura. Estos nematodos inducen el desarrollo de células especiales de alimentación, denominadas células gigantes (CGs), contenidas en las agallas y que son la fuente de nutrientes para el nematodo. Durante este proceso de diferenciación, las CGs se agrandan, se vuelven multinucleadas y adquieren un citoplasma denso y un metabolismo altamente activo. Todavía no se han elucidado los mecanismos a través de los cuales el nematodo es capaz de inducir este nuevo órgano en la raíz después de establecerse y así completar su ciclo vital. En este contexto, el tema principal de la investigación desarrollada en esta tesis doctoral es profundizar en el conocimiento de las vías de regulación paralelas y divergentes durante el desarrollo de agallas y/o CGs con procesos de desarrollo postembrionario, como la formación de raíces laterales (RLs) o de callos. Para ello ha sido necesario establecer y optimizar diversos protocolos. En un primer lugar hemos desarrollado un sistema simple y eficiente para la amplificación y mantenimiento de manera prolongada de poblaciones de nematodos del género Meloidogyne en un cultivo in vitro monoaxénico de raíces de pepino. Además, para poder estudiar los mecanismos moleculares implicados en la formación de agallas y CGs desarrollamos dos métodos. El primero consiste en un protocolo estandarizado para evaluar las tasas de infección y/o reproducción de los RKNs y los nematodos formadores de quistes (Heterodera y Globodera spp.) en mutantes de Arabidopsis thaliana con alteraciones en el desarrollo de RLs relacionadas con la señalización de auxinas y citoquininas. El segundo método nos permite fenotipar de forma rápida, reproducible y fiable las CGs en cualquier etapa de su desarrollo y obtener parámetros cuantitativos de su área y/o volumen, así como su reconstrucción tridimensional, para determinar variaciones morfométricas durante su desarrollo. Para ello se lleva a cabo un análisis de imágenes obtenidas por microscopía confocal de agallas fijadas con glutaraldehído y clarificadas con alcohol bencílico y benzoato de bencilo (BABB). Dado el rendimiento de la técnica, se consiguió también el estudio de agallas en otras especies vegetales, como pepino, así como de otras interacciones bióticas, como los sincitios formados por Heterodera spp. o los nódulos desarrollados por Rhizobium spp. Nuestro interés por investigar las células precursoras o células madre de las CGs y otros tejidos de la agalla, nos llevó a demostrar por primera vez cómo los RKNs son capaces de infectar y completar su ciclo vital en un cultivo in vitro de explantes de hojas de Arabidopsis. Para ello desarrollan de forma ectópica CGs funcionales y con similares características a aquellas que forman en las agallas de raíz. El gen LATERAL ORGAN BOUNDARIES-DOMAIN 16 (LBD16) resultó ser esencial en la formación de estas CGs en hojas, como también lo es para el desarrollo de RLs, callos y agallas en raíz. Nuestro grupo aisló CGs a tiempos temprano de infección mediante microdisección por láser y estudió su transcriptoma en Arabidopsis revelando similitudes con el transcriptoma de células indiferenciadas del meristemo apical de la raíz (RAM) y de los primordios de RLs. Además, determinamos que los tránscritos característicos de las células de primordios de RL, endodermis y centro quiescente fueron los más abundantes dentro del transcriptoma de agallas de desarrollo temprano. En este contexto hemos estudiado la participación de genes reguladores clave del RAM, como son SHORT-ROOT (SHR), SCARECROW (SCR), SCHIZORIZA (SCZ) y WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 5 (WOX5) en la formación de agallas. Estos genes se inducen, y la mayoría son funcionales en las agallas inducidas por Meloidogyne javanica en Arabidopsis. Para ahondar en el estudio de los paralelismos entre el desarrollo de RLs y agallas, analizamos la expresión y la función de genes implicados en las vías de transducción criticas durante las primeras etapas de la formación de las RLs. ABERRANT LATERAL ROOT FORMATION 4 (ALF4), SOLITARY ROOT (SLR/IAA14), BONDELOS (BDL/IAA12), INDOLE-3-ACETIC ACID INDUCIBLE 28 (IAA28), AUXIN RESPONSE FACTOR 5 (ARF5), GATA TRANSCRIPTION FACTOR 23 (GATA23), S-PHASE KINASE-ASSOCIATED PROTEIN2 (SKP2B), HISTIDINE PHOSPHOTRANSFER PROTEIN 6 (AHP6) mostraron un papel crucial también durante el desarrollo de agallas, algo que no sucedió con otros genes como AUXIN RESPONSE FACTORS 7 y 19 (ARF7 y ARF19). Aun así, la formación de agallas en sus etapas iniciales presenta importantes similitudes con el programa de desarrollo de las RLs y a su vez con el de callos, posiblemente compartiendo, al menos parcialmente, rutas de transducción de señales comunes en ambos procesos de generación de nuevos órganos. Al reclutar parte de esas vías de desarrollo ya establecidas en la raíz, los nematodos promueven tanto la adquisición de nuevas identidades celulares como la reprogramación celular, lo que conduce a la generación de nuevas células con capacidad meristemática en el tejido vascular de la raíz, que posiblemente generen este nuevo órgano, la agalla.