Ingeniería metabólica para la producción de biolípidos a partir de residuos industriales ricos en xilosa en ashbya gossypii

  1. Díaz Fernández, David
Supervised by:
  1. Alberto Jiménez García Director
  2. José Luis Revuelta Doval Director

Defence university: Universidad de Salamanca

Fecha de defensa: 06 July 2020

Committee:
  1. Margarita María Díaz Martínez Chair
  2. Rodrigo Ledesma Amaro Secretary
  3. Alvaro Peix Committee member
Department:
  1. MICROBIOLOGÍA Y GENÉTICA

Type: Thesis

Teseo: 630018 DIALNET

Abstract

INTRODUCCIÓN La sociedad actual es cada vez más exigente y está más concienciada en la necesidad de un cambio en el modelo económico y energético hacia un modelo de economía circular. Dentro de este contexto de transición ecológica y energética hacia un modelo de emisión cero de gases de efecto invernadero, el aprovechamiento de residuos industriales para bioprocesos de fermentación microbiana tiene una importancia cada vez mayor en la industria biotecnológica1. Algunos de estos residuos industriales de bajo costo son los hidrolizados lignocelulósicos ricos en xilosa, las melazas de la industria azucarera y el glicerol crudo entre otros co-productos de desecho industrial2–4. En este trabajo se aborda la utilización del hongo filamentoso Ashbya gossypii como chasis biotecnológico para la producción de lípidos microbianos mediante la valorización de formulaciones mixtas de hidrolizados lignocelulósicos ricos en xilosa, melazas de la industria azucarera y glicerol crudo. A. gossypii es un hongo filamentoso de la familia Saccharomycetaceae que, desde el punto de vista evolutivo, está relacionado estrechamente con la levadura Saccharomyces cerevisiae5. Más del 90% de los genes de A. gossypii presentan ortólogos en el genoma de S. cerevisiae. Además, existe un patrón de conservación del orden de los genes (sintenia) en amplios segmentos genómicos de A. gossypii y S. cerevisiae5. En cuanto a la producción de lípidos, se han descrito cepas de A. gossypii capaces de alcanzar niveles elevados de contenido lipídico mediante el bloqueo del catabolismo de los ácidos grasos y la adición de ácido oleico como principal fuente de carbono en el medio de cultivo6. 1. INGENIERÍA METABÓLICA PARA EL APROVECHAMIENTO DE XILOSA EN Ashbya gossypii A. gossypii no puede usar xilosa como única fuente de carbono para generar biomasa; sin embargo es capaz de producir xilitol cuando crece en un medio de cultivo que contiene xilosa7. Se identificaron los genes de A. gossypii ACL107C, ABR229C y AGR324C como homólogos de los genes GRE3, XYL2 y XKS1 de S. cerevisiae, que codifican para xilosa reductasa (XR), xilitol deshidrogenasa (XDH) y xilulosa quinasa (XK), respectivamente. Se analizó la expresión de los genes ACL107C, ABR229C y AGR324C en la cepa tipo silvestre de A. gossypii mediante PCR cuantitativa y se comprobó su escaso nivel de expresión, lo cual explica la incapacidad de A. gossypii de metabolizar xilosa. La vía de asimilación de xilosa XR-XDH-XK ha sido utilizada con éxito para generar cepas de diferentes bacterias y levaduras capaces de metabolizar la xilosa8; por tanto, asumiendo que Acl107c, Abr229c y Agr324c pueden participar en el metabolismo de la xilosa en A. gossypii, se decidió sobreexpresar estos tres genes de A. gossypii para permitir el aprovechamiento de xilosa en A. gossypii. La generación de una cepa de triple sobreexpresión (GXX) se logró después de tres rondas de transformación sobre la cepa silvestre de A. gossypii. La sobreexpresión de genes endógenos en A. gossypii se lleva a cabo mediante la sustitución de los promotores endógenos por el promotor constitutivo fuerte PGPD1. La cepa GXX mostró un crecimiento exponencial durante las primeras 72 horas de cultivo con una tasa de crecimiento específico de 0,0537 h-1, y alcanzó 7-8 g/L de biomasa en medios con xilosa como única fuente de carbono. Con los resultados obtenidos se puede concluir que la sobreexpresión de los genes endógenos GRE3, XYL2 y XKS1 de A. gossypii es suficiente para permitir el aprovechamiento de la xilosa como única fuente de carbono, siendo la capacidad de crecimiento de la cepa GXX similar a la observada cuando se emplea glucosa como fuente de carbono. 2. CANALIZACIÓN DE FLUJO METABÓLICO DE XILOSA HACIA LA BIOSÍNTESIS DE LÍPIDOS Nuestro principal objetivo consiste en redirigir flujo metabólico desde el metabolismo de xilosa hacia la síntesis de ácidos grasos. La sobreexpresión de una vía de la fosfocetolasa recombinante permite dirigir flujo metabólico desde X5P hacia AcCoA, que es el precursor inmediato de la biosíntesis de lípidos. Por lo tanto, se decidió llevar a cabo la sobreexpresión heteróloga de enzimas de la vía de la fosfocetolasa en la cepa GXX de A. gossypii, dando lugar a la cepa GXX-PX. Se emplearon las secuencias codificantes de las enzimas fosfotransacetilasa (pta) y Xu5P fosfocetolasa (xpkA) de Bacillus subtilis y Aspergillus nidulans, respectivamente. Mediante un análisis de la capacidad lipidogénica de A. gossypii, se comprobó que la sobreexpresión de la ruta de la fosfocetolasa contribuye a incrementar la producción de lípidos desde un 8,85% en la cepa GXX a un 11,82% en la cepa GXX-PX. Por lo tanto, este resultado demuestra que la sobreexpresión combinada de las rutas XR-XDH-XK y fosfocetolasa es una estrategia acertada para la producción de lípidos a partir de xilosa en A. gossypii. 3. DESREGULACIÓN DE LA BIOSÍNTESIS DE LÍPIDOS EN A. gossypii Se ha descrito la existencia de mecanismos reguladores de la biosíntesis de ácidos grasos como la inhibición por producto final de la enzima acetil-CoA carboxilasa (Acc1) y de la sintasa de ácidos grasos (FAS). La eliminación de estos mecanismos de regulación ha logrado aumentar significativamente la biosíntesis de lípidos en microorganismos como Y. lipolytica9,10. A continuación, se describen tres estrategias de ingeniería metabólica que se llevaron a cabo para la desregulación de la biosíntesis de ácidos grasos en A. gossypii. La primera estrategia tuvo como objetivo reducir el pool de acil-CoA saturados para prevenir la inhibición sobre Acc1 y FAS. Los genes OLE1 y OLE2 de A. gossypii codifican enzimas con actividad desaturasa Δ911. Se ha descrito que la proteína Mga2 de S. cerevisiae participa en la estabilización del mRNA de OLE1, influyendo positivamente en la síntesis de ácidos grasos saturados12. Además, en A. gossypii se ha descrito que la expresión de una forma truncada en el extremo C-terminal de la proteína Mga2 (Mga2-ΔC-term) provoca un aumento significativo del contenido total de ácidos grasos en A. gossypii11. Se decidió por tanto expresar la forma truncada de la proteína Mga2 en la cepa GXX-PX para comprobar si se producía este mismo efecto en medios basados en xilosa como fuente de carbono principal. Para obtener la forma truncada de Mga2, el extremo C-terminal (aminoácidos 850-1139) fue sustituido por el marcador de selección loxP-KanMX-loxP. La segunda estrategia para la eliminación de la regulación de la biosíntesis de lípidos consistió en la abolición de la regulación postraduccional de Acc1 en A. gossypii. En S. cerevisiae se ha descrito que la sustitución de los residuos Ser659 y Ser1157 por residuos no fosforilables evita la regulación de Acc1 mediante fosforilación9, dando como resultado una mayor actividad de Acc113. Mediante una búsqueda en la base de datos genómica de A. gossypii, se comprobó que los residuos fosforilables Ser659 y Ser1157 están conservados en la enzima Acc1 de A. gossypii. Se construyó un módulo de sobreexpresión para el reemplazamiento genómico del gen ACC1 por el alelo mutante acc1S659A, S1155A, en el cual se sustituyeron los residuos Ser659 y Ser1155 por alaninas (Ala) mediante la mutación de la timina 1975 a guanina (T1975G) y de la timina 3463 a guanina (T3463G). Por último, se decidió una tercera y última estrategia para superar los mecanismos regulatorios de la biosíntesis de ácidos grasos descritos anteriormente. Para reducir el pool de acil-CoA graso se planteó la sobreexpresión de una copia adicional del gen DGA1 de A. gossypii, redirigiéndose esta acumulación de acil-CoA graso hacia la biosíntesis de triacilgliceroles. Esto produce un aumento de las capacidades lipidogénicas, ya que se ha descrito que la sobreexpresión de este gen aumenta la cantidad total de lípidos producida en Y. lipolytica9. Otro efecto de la sobreexpresión de DGA1 es la disminución de los efectos reguladores negativos de los acil-CoA grasos saturados e insaturados en la enzima Acc1, el complejo enzimático FAS y la desaturasa ∆9 codificada por el gen OLE1. Se construyó así la cepa A877 sobre la cepa parental GXX-PX, que combina las tres manipulaciones genéticas descritas anteriormente para desregular la biosíntesis de ácidos grasos. La cepa A877 alcanzó un 25% de lípidos totales respecto de la biomasa total en un medio con xilosa como única fuente de carbono (1,5 veces más que la cepa parental GXX-PX). 4. APROVECHAMIENTO DE RESIDUOS INDUSTRIALES PARA PRODUCCIÓN DE LÍPIDOS EN Ashbya gossypii Los resultados anteriormente descritos sugieren que la cepa A877 es un biocatalizador prometedor para la producción de lípidos microbianos. A continuación, se describen las capacidades lipidogénicas y las cinéticas de crecimiento de esta cepa utilizando diferentes formulaciones mixtas de residuos industriales. Se cultivaron las cepas GXX-PX y A877 en medios que contenían 50% v/v de hidrolizados de residuos lignocelulósicos de mazorca de maíz (CCh) detoxificado más 4% p/v de melazas de caña de azúcar. Nuestros resultaron mostraron que ambas cepas pudieron utilizar la xilosa y la sacarosa de los medios de cultivo para el crecimiento celular. El efecto positivo de la utilización de formulaciones mixtas de residuos industriales se pudo comprobar comparando la producción lipídica total de la cepa A877 en distintos medios de cultivo: medio con hidrolizados CCh, medio con melazas con caña de azúcar y medio con una mezcla de ambos residuos industriales. El contenido lipídico total más elevado se alcanzó en el medio con mezcla de hidrolizados CCh y melazas (38,1% lípidos respecto de la biomasa total producida; 2,4 veces más que la cepa parental GXX-PX). Las cepas GXX-PX y A877 también fueron cultivadas en medios que contenían 50% v/v de hidrolizados CCh detoxificados más 1% p/v de glicerol crudo. El análisis del rendimiento de crecimiento de ambas cepas en este medio reveló que mientras la cepa GXX-PX mostró una co-utilización simultánea de glicerol y xilosa, la cepa A877 exhibió una tasa de consumo más baja para la xilosa. La cepa A877 llega a acumular un 29,3% de lípidos respecto de la biomasa total producida usando una mezcla de hidrolizados CCh y glicerol crudo, demostrando nuevamente la eficiencia de la cepa para la utilización de mezclas de residuos industriales. Se puede concluir que los resultados aquí presentados muestran la capacidad de A. gossypii de ser utilizado como chasis biotecnológico para la valorización de residuos industriales hacia la producción de compuestos de alto valor añadido, como los lípidos microbianos.