The greatwall-endosulfine-pp2a/b55 pathway in schizosaccharomyces pomberegulatory mechanisms androles in cell differentiationand ageing

Resumen

El crecimiento celular está normalmente acoplado a la división celular para dar lugar a un órgano u organismo de un tamaño determinado. Cuando las células proliferan, mantienen un tamaño constante y la división celular se produce cuando la masa celular se duplica. No obstante, el tamaño celular está modulado por las condiciones nutricionales (Fantes and Nurse, 1977). En medios ricos en nutrientes, la tasa de crecimiento es elevada y el tamaño celular aumenta. Por el contrario, en ambientes nutricionales pobres, las células reducen la síntesis de macromoléculas y disminuyen de tamaño. La progresión por el ciclo celular está controlada por los complejos CDK/Ciclina. Las oscilaciones en su actividad dependen de los niveles y de la especificidad de la Ciclina (Bloom and Cross, 2007; Loog and Morgan, 2005), y activan la transición por las distintas fases del ciclo celular (Nurse, 1990). Sin embargo, múltiples estudios recientes han puesto de manifiesto la importancia de las proteínas fosfatasas en el control del ciclo celular (Cundell et al., 2013, 2016; Domingo-Sananes et al., 2011; Grallert et al., 2015; Mochida and Hunt, 2012). De hecho, el equilibrio entre la actividad CDK/Ciclina y las fosfatasas que la contrarrestan determina el estado de fosforilación de los sustratos de los complejos CDK/Ciclina (Cundell et al., 2016). En metazoos, la proteína fosfatasa PP2A/B55 juega un papel esencial en la progresión del ciclo celular, ya que antagoniza la fosforilación de las dianas de CDK/Ciclina (Mochida et al., 2009). En concreto, la entrada en mitosis es el resultado del balance entre la actividad quinasa del complejo Cdk1/CiclinaB y la actividad fosfatasa de PP2A/B55 (Glover, 2012; Lorca and Castro, 2013). Durante la interfase, PP2A/B55 promueve la activación de Wee1 (Mueller et al., 1995) y la inhibición de Cdc25 (Pal et al., 2008), asegurando que los niveles de Cdk1/CiclinaB se mantienen bajos en G2, y, por tanto, evitando que las células entren en mitosis (Mochida et al., 2009). En la transición G2/M, la inhibición de PP2A/B55 permite que los niveles de actividad Cdk1/CiclinaB aumenten y se desencadene, así, el inicio de la mitosis. El módulo Greatwall-Endosulfina es el responsable de inactivar PP2A/B55 al final de la fase G2 (Glover, 2012; Lorca and Castro, 2013). Greatwall es una serina/treonina quinasa que fosforila a Endosulfina, promoviendo su interacción con PP2A/B55 y la inactivación de esta fosfatasa (Gharbi-Ayachi et al., 2010; Mochida et al., 2010). Curiosamente, el complejo Cdk1/CiclinaB regula la actividad del módulo Greatwall-Endosulfina en animales. En la fase G2 tardía, Greatwall es fosforilado por Cdk1/CiclinaB, lo que promueve su autofosforilación y activación completa (Blake-Hodek et al., 2012; Vigneron et al., 2011). Una vez activo, Greatwall fosforila a Endosulfina, lo cual favorece que Endosulfina interaccione e inhiba al complejo fosfatasa PP2A/B55. Como consecuencia, la actividad Cdk1/CiclinaB se dispara, los sustratos mitóticos se fosforilan y comienza la mitosis. La quinasa TOR posee una función central en la regulación del crecimiento celular y la proliferación en los organismos eucariotas. Esta serina/treonina proteína quinasa se ensambla en dos complejos proteicos, el Complejo TOR 1 (TORC1) y el complejo TOR 2 (TORC2), cuyas funciones están conservadas a lo largo de la evolución. TORC1 controla el crecimiento y es activado por nutrientes, factores de crecimiento y hormonas. Para estimular el crecimiento celular, TORC1 promueve procesos anabólicos, como la biosíntesis de proteínas, la biogénesis de ribosomas o la transcripción; e inhibe procesos catabólicos, como la autofagia y la diferenciación celular (Alvarez and Moreno, 2006; Matsuo et al., 2007; Saxton and Sabatini, 2017; Uritani et al., 2006). Por su parte, TORC2 desempeña una gran variedad de funciones celulares, desde la regulación del citoesqueleto de actina, la endocitosis, la biosíntesis de lípidos, la respuesta a daño en el ADN y a distintos tipos de estrés, la citoquinesis, el silenciamiento génico, el mantenimiento de los telómeros y la diferenciación celular (revisado en Eltschinger and Loewith, 2016; Gaubitz et al., 2015; Weisman, 2016). En levaduras, el módulo Greatwall-Endosulfina conecta el crecimiento celular con el ciclo celular al modular la actividad de la fosfatasa PP2A/B55. En S. cerevisiae, Greatwall y Endosulfina son reguladas negativamente por PKA y TORC1 (Pedruzzi et al., 2003). La actividad de este módulo es necesaria para la expresión de genes meióticos y para la supervivencia en la fase G0 (Pedruzzi et al., 2003; Reinders et al., 1998; Talarek et al., 2010; Vidan and Mitchell, 1997). Por el contrario, en S. pombe, solo TORC1 regula negativamente el módulo Greatwall-Endosulfina (Chica et al., 2016). En medios ricos en nutrientes, la actividad de TORC1 es elevada, potenciando la inhibición de Greatwall y con ello la activación de PP2A/B55. Niveles altos de PP2A/B55 contrarrestan la activación de Cdk1/CiclinaB y las células entran en mitosis con un tamaño grande. Sin embargo, en medios pobres, la actividad de TORC1 cae, Greatwall se activa y fosforila a Endosulfina, que a su vez inhibe a PP2A/B55, permitiendo la activación prematura de Cdk1/CiclinaB y la entrada en mitosis con menor tamaño. En la levadura de fisión, el módulo Greatwall-Endosulfina controlan el tamaño de división celular (Chica et al., 2016), la entrada en quiescencia (Aono et al., 2019) y la respuesta transcripcional necesaria para la diferenciación sexual (Laboucarié et al., 2017; Martín et al., 2017). En esta Tesis Doctoral, se han estudiado los mecanismos moleculares implicados en la regulación de la ruta de Greatwall-Endosulfina-PP2A/B55 y su función en Schizosaccharomyces pombe. En particular, la Tesis se centra en: (1) examinar la implicación de la ruta en la regulación del bloqueo en la fase G1 en ausencia de nitrógeno, (2) diseccionar su papel en la respuesta de diferenciación sexual, (3) analizar su función en la regulación del envejecimiento celular, (4) caracterizar los cambios de fosforilación que regulan la actividad de Endosulfina, (5) e identificar posibles nuevas dianas de las proteínas Endosulfina y B55. Los resultados obtenidos en este proyecto se engloban en cuatro grandes apartados. En primer lugar, la ruta de Greatwall-Endosulfina-PP2A/B55 juega un papel crucial en la regulación de la respuesta celular de la levadura de fisión a la falta de nitrógeno. Greatwall y Endosulfina regulan negativamente la actividad de PP2A/B55, permitiendo la reducción del tamaño celular, el bloqueo en G1 y diferenciación sexual en ausencia de nitrógeno. En segundo lugar, el módulo Greatwall-Endosulfina promueve la entrada en la fase G0, la supervivencia celular y la correcta dinámica de la cromatina durante la quiescencia. La inactivación de PP2A/B55 mediada por Greatwall y Endosulfina es necesaria para la supervivencia celular en la fase G0 inducida por la falta de nitrógeno. En tercer lugar, varias quinasas fosforilan a Endosulfina in vivo, incluidas Cdk1 y PKA. La fosforilación de las serinas 31, 89, 102 y 118 de Endosulfina llevada a cabo por Cdk1/CiclinaB promueve la actividad de Endosulfina en medio rico en nitrógeno. Por último, los interactomas de Endosulfina y B55 muestran múltiples interacciones con otras proteínas. En concreto, B55 interacciona con varios complejos de proteínas involucrados tanto en la condensación y remodelación de la cromatina, como en la modificación de histonas, lo que apoya la hipótesis de que PP2A/B55 participa en la regulación del silenciamiento de la cromatina durante la entrada en quiescencia.