Chemical modification of proteins, applications in inmobilization, catalytic performance and fluorescent labeling

Resumen

RESUMEN Esta tesis doctoral titulada "Modificación química de proteínas, aplicaciones en inmovilización, actividad catalítica y marcaje fluorescente" tiene como objetivo desarrollar metodologías de modificación química de proteínas y aplicaciones de las mismas. La tesis se ha dividido en cuatro bloques en cada uno de los cuales se aborda una metodología de modificación de proteínas y se propone una o más aplicaciones de la metodología. En un primer bloque de contenido se plantea mejorar la tecnología de inmovilización "sin soporte": CLEAs (cross-linked enzyme aggregates) usando reactivos diepóxido para unir entre si las proteínas. El método de fabricación de epoxy-CLEAs se estudió y optimizo con la metodología de superficie de respuesta, obteniéndose epoxy-CLEAs estables y activas. Las expoxy-CLEAs se fotografiaron mediante microscopia tomográfica. El método de fabricación también se aplicó a la fabricación de CLEAs magnéticas. Los agregados conservan igualmente la actividad catalítica y tienen la ventaja de poder ser retirados del medio de reacción usando un imán de neodimio, facilitando la purificación del producto final y el reusó del biocatalizador. En el segundo bloque la lacasa de Trametes versicolor inmovilizó sobre soportes de sílice o dentro de los poros de los soportes, tanto comerciales como sintetizados en el laboratorio. Se preparó así un biocatalizador de lacasa que se aplicó a la síntesis de dos fenoxiazonas: Curie 22 y el ácido cinabarinico. En un tercer bloque se propone la modificación directa de nanopartículas magnéticas (9-12 nm). Estas partículas son funcionalizadas directamente por sustitución nucleofílica con haluros orgánicos. Usando las nanopartículas funcionalizadas se propone un método sostenible para obtener un acetato de bencilo seminatural en un sistema libre de disolvente, usando lipasas inmovilizadas sobre las partículas. El cuarto y último bloque es la aplicación de derivados fluorescentes sintetizados en el laboratorio para aplicarlos en biología molecular y celular. Se han sintetizado compuestos incorporando moléculas fluorescentes a reactivos que tienen algún tipo de afinidad con proteínas. Los compuestos se han usado para marcar proteínas en medio líquido, teñir geles de acrilamida, cuantificar proteínas y teñir células, obteniéndose resultados alentadores.