Obtención de subproductos con elevado valor añadido a partir de Residuos de Productos Cárnicos destinados al consumo humano

Resumen

Los residuos domésticos, también denominados municipales, debido a su origen se produce una mayor cantidad de estos residuos cuanto mayor sea el nivel de vida En el caso de España, aunque la generación de residuos domésticos era superior a la de la media europea en 2005, en 2019 era inferior debido a las políticas de gestión de residuos y legislaciones más restrictivas que han llevado a una reducción en la generación de residuos municipales Dentro de la media española, la comunidad autónoma de Castilla y León presenta la misma tendencia descendente, pero tiene una generación de residuos municipales ligeramente inferior a la nacional. Si bien la disminución en la generación de residuos municipales en la Comunidad de Castilla y León y, en general, en España es algo excelente, el problema surge cuando se analiza el destino de estos residuos. Mientras en la Unión Europea un 76 % de los residuos es recuperado en forma de reciclado, compost o por valorización energética y sólo un 24 % es llevado a vertedero, en España, ocurre lo contrario: el 54 % son depositados en vertedero y sólo una proporción del 46 % son recuperados de una forma u otra. En los estudios hechos por nuestro grupo de investigación de Gestión Ambiental y Aprovechamiento de Recursos de la Universidad de Salamanca, en cuyas investigaciones se enmarca este trabajo, el porcentaje llevado a vertedero aumenta hasta un 70 % en la Comunidad de Castilla y León. Esto indica la necesidad de mejorar el tratamiento de residuos en España para reducir la cantidad de estos llevada a vertedero con el fin de proteger, preservar y optimizar la calidad del medio ambiente, así como proteger la salud humana, garantizando la utilización prudente, eficiente y racional de los recursos naturales. Partiendo de esta problemática, se ha examinado la causa de la elevada cantidad de residuos sólidos llevada a vertedero en España, buscando una solución al problema. Las caracterizaciones llevadas a cabo por nuestro grupo de investigación en las bolsas “todo uno” en la Comunidad de Castilla y León reflejaron un contenido en materia orgánica mucho más elevado. Teniendo en cuenta que, de acuerdo con el modelo actual de gestión de residuos domiciliarios dado en el Plan Integral de Residuos de Castilla y León, el residuo que llega en la bolsa “todo uno” a los Centros de Tratamiento de Residuos (CTRs) se separa en varias fracciones y que solamente una de ellas, la fracción rechazo, es la que se lleva a vertedero, obviamente, el problema radica en esta fracción ya que más del 50 % del mismo es material biodegradable En relación con la cantidad de material biodegradable destinada a vertedero hay que reseñar que el Plan Estatal Marco de Gestión de Residuos limita esa cantidad de modo que, desde el año 2016, no puede superar el 35 % de los residuos biodegradables generados en 1995, límite que no se está cumpliendo en la Comunidad de Castilla y León. Esta situación hace necesario buscar una alternativa para conseguir la reducción de materia biodegradable depositada en vertedero. Analizada la procedencia de esa materia orgánica, se aprecia que la parte más fácil de separar en origen es la correspondiente a los residuos orgánicos de carnicería, pescadería y frutería que son generados en cantidades muy elevadas y que pueden separarse en los propios comercios en los que se originan. Comprobándose que los residuos de fruterías tienen como componente mayoritario los hidratos de carbono mientras que los residuos de carnicería y pescadería tienen como componentes mayoritarios proteínas y lípidos. Dado que las proteínas y los lípidos, así como sus derivados, alcanzan un mayor precio en el mercado que los hidratos de carbono, y que la cantidad de residuos orgánicos generada en carnicerías es muy superior a las cantidades de residuos orgánicos generados en pescaderías, este trabajo se centró en la separación en origen de los residuos generados en carnicerías para su transformación en productos con mayor valor añadido. Para llevar a cabo la transformación se eligió la hidrólisis para poder obtener hidrolizados de proteína y separar los ácidos grasos, y, dentro de la hidrólisis, se optó por la hidrólisis enzimática en lugar de la ácida o la básica porque requiere unas condiciones de operación más suaves y es más específica. La metodología seguida ha consistido en la recogida, triturado y tamizado del residuo de carnicerías con el objeto de obtener una muestra homogénea y representativa que ha sido dividida en porciones y congelada para su uso posterior. El residuo descongelado fue caracterizado y fue sometido a hidrólisis enzimática el cual se contó con un equipo teniendo un reactor encamisado con control de temperatura y pH durante un tiempo determinado. Transcurrido el tiempo de hidrólisis fijado se desactiva la enzima por calentamiento a elevada temperatura durante unos minutos y el contenido del reactor se centrifuga y filtra para obtener las tres fases finales: la fase sólida en la que se determinó el colágeno no hidrolizado, la fase acuosa en la que se determinó la proteína solubilizada indicativa del hidrolizado obtenido y la fase lipídica en la que se determinó el contenido en ácidos grasos. Previamente a las hidrólisis, los residuos fueron caracterizados, determinando que tenían una humedad del 45,04%; y, en base seca, un porcentaje mayoritario de proteína del 19 % y de lípidos del 69%. En el residuo se analizó específicamente la presencia de colágeno en un 6,8 %; hay que destacar que el colágeno es la proteína más abundante en los animales y, por tanto, también en sus residuos. En la caracterización del sustrato también se determinaron otros parámetros como la densidad que resultó ser de 1,19 g/ml y se utilizó para determinar posteriormente el volumen de sustrato puesto en el reactor de hidrólisis y el índice de saponificación cuyo valor fue de 200 y con el que se determinó el peso molecular medio de los lípidos y de los ácidos grasos contenidos en ellos. Por otra parte, dentro de los lípidos se ha determinado la composición en ácidos grasos que los constituyen. Dado que no existen datos en la bibliografía relativos al contenido en ácidos grasos en los residuos de carnicería, se hizo una revisión bibliográfica sobre el contenido en ácidos grasos en distintas carnes y grasas animales. En ella se observó cómo ese contenido variaba enormemente en función de que la muestra fuera de carne o de grasa y que también variaba mucho dependiendo del origen de la carne o de la grasa. Los porcentajes obtenidos para cada ácido graso están todos ellos dentro del intervalo de valores de la bibliografía lo que parece indicar la coherencia de los resultados obtenidos, predominando los ácidos saturados (46,64 %) frente a los monoinsaturados (25,27 %) o poliinsaturados (28,09 %). Una vez caracterizado el residuo se procedió a la hidrólisis del mismo comenzando por su fracción proteica. La enzima actúa sobre los enlaces peptídicos, rompiéndolos, y liberando en presencia de agua grupos amino y grupos carboxilo. La liberación de grupos carboxilo hace que el pH del reactor disminuya. Como la actividad de las enzimas es muy sensible al pH, con el fin de mantener el mismo constante, será preciso utilizar el método del pHestato consistente en adicionar durante el proceso una base. El proceso se ha seguido mediante el grado de hidrólisis (GH) que se define como el cociente entre el número de enlaces peptídicos rotos y el número de enlaces peptídicos totales El número de enlaces peptídicos hidrolizados se calcula a partir de: Los equivalentes de NaOH añadidos calculados por el producto del volumen de base consumido B y su normalidad NB La masa de proteína mp Y el grado de disociación α cuyo valor depende del pH y la temperatura de trabajo. El número de enlaces peptídicos htotal en la proteína de carnes de 7.6 eqv/kg En los estudios de hidrólisis con proteasas se comenzó con la selección de la proteasa más adecuada. Para ello se utilizaron cinco proteasas comerciales: Alcalase, Protamex, Flavourzyme, PTN y Neutrase. Se han elegido estas proteasas por sus diferentes características en cuanto a: Su origen: Bacterianas, fúngicas o animales Su actividad catalítica: endopeptidasa, exopeptidasa o endo+exopeptidasa Su punto catalítico: proteasa serina, aminopeptidasa o metaloproteasa Y su pH óptimo: Alcalinas o neutras Las condiciones de operación para llevar a cabo las hidrólisis han sido las mismas para todas las proteasas con la finalidad de comparar, en idénticas circunstancias, los resultados obtenidos en el proceso: pH 8, temperatura 50oC, agitación 300 rpm, concentración de sustrato 17,5 g/l y concentración de enzima 2,8 UA/l. Estas condiciones de operación se establecieron en función de las características de las proteasas, seleccionando los valores de pH y temperatura para los cuales la práctica totalidad de las proteasas ensayadas muestran máxima actividad. La concentración de sustrato proteico se seleccionó en función de las condiciones de agitación del sustrato en el reactor enzimático y la concentración de proteasa a partir de lo recomendado en estudios bibliográficos para residuos de similares características. Los resultados de los grados de hidrólisis obtenidos indican que de las tres endopeptidasas de origen bacteriano analizadas (Alcalase, Neutrase, y Protamex), Neutrase resulta menos eficaz que las otras endopeptidasas lo que puede atribuirse a un papel importante y crítico de las proteasas serinas frente a las metaloproteasas para la hidrólisis de residuos cárnicos. Esto se puede apreciar en la figura, donde Protamex (una preparación de proteasa serina y metaloproteasa) tiene una eficacia inferior a la de Alcalase (proteasa serina pura) pero claramente superior a la de Neutrase (metaloproteasa pura) si se desea un alto valor del GH. Dentro de las endopeptidasas de origen bacteriano, también se puede apreciar que las proteasas alcalinas (Alcalase) resultan más adecuadas para la hidrólisis de los residuos cárnicos que las proteasas neutras (Protamex y Neutrase). La enzima Flavourzyme, con unas características diferentes a las demás proteasas ensayadas en cuanto a origen (fúngico), actividad catalítica (endo+exopeptidasa), punto catalítico (aminopeptidasa) y carácter neutro, presenta una eficacia intermedia análoga a la de la enzima PTN que parece sugerir que su eficacia se puede asimilar a las de las proteasas serinas alcalinas de origen animal y actividad endopeptidasa. Si se comparan las proteínas serinas con actividad endopeptidasa en función de su origen, se puede apreciar que las de origen bacteriano, como Alcalase, permiten alcanzar un mayor GH en la hidrólisis de estos residuos que las de origen animal, como PTN. De todo ello se deduce que la proteasa más adecuada para obtener un elevado grado de hidrólisis y, por ello, mayor cantidad de hidrolizado proteico es la Alcalase. En cuanto a los productos obtenidos, se ha observado que el porcentaje de proteína solubilizada indicador de la cantidad de hidrolizado proteico es superior cuando se utiliza Alcalase. Lo mismo ocurre con el porcentaje de lípidos recuperados indicador de la cantidad de lípidos recuperados; si bien, éstos no son hidrolizados en presencia de proteasas, al hidrolizarse las proteínas se favorece la liberación de los lípidos presentes en el residuo, aumentando por ello la cantidad de lípidos liberados. Como consecuencia de la liberación de lípidos y la solubilización de proteínas, también es la Alcalase la que reduce más el porcentaje de residuos no transformados en subproductos. Sin embargo, es la Neutrase la que permitiría recuperar un mayor porcentaje del colágeno presente en el residuo cárnico ya que es la proteasa con la que se produce una menor hidrólisis de las proteínas. Independientemente del tipo de proteasa utilizada, el análisis del perfil de ácidos grasos en los lípidos recuperados tras la hidrólisis indica que no hay cambio significativo respecto a la composición de la grasa del residuo antes de ser hidrolizado manteniéndose la misma distribución de ácidos grasos. Por tanto, la hidrólisis con proteasas parece ser un medio efectivo para la recuperación de los lípidos sin afectar su calidad. Dado que la cantidad de hidrolizado proteico es muy superior a la de colágeno recuperado y el precio de esos hidrolizados es ligeramente superior al precio del colágeno, se optó, en función del valor añadido de los productos y los resultados comentados, seleccionar la Alcalase como proteasa más adecuada en el proceso y trabajar con ella en los estudios posteriores. En el estudio de la hidrólisis de la fracción proteica del residuo cárnico con Alcalase, se han llevado a cabo experimentos para distintas condiciones de operación: variando las concentraciones iniciales de enzima entre 0,9 y 4,7 UA/l y la concentración de sustrato entre 3 y 35 g/l, la relación entre ambas entre 0,05 u 0,81 UA/g, el pH entre 7 y 9 y la temperatura entre 40 y 60oC. La duración de las hidrólisis se fijó en un tiempo de cuatro horas porque se observó que en el intervalo entre la tercera y la cuarta hora el grado de hidrólisis apenas variaba un 1 % por lo que tiempos de hidrólisis superiores no eran económicamente rentables. En los estudios realizados sobre la influencia de la concentración inicial de enzima y de sustrato sobre el grado de hidrólisis, se han obtenido los resultados mostrados en la pantalla, donde se observan las curvas de hidrólisis obtenidas que muestran una velocidad de reacción alta en los primeros minutos seguida de una reducción de la misma compatible con la disminución de enlaces péptidos susceptibles de ser hidrolizados a medida que avanza el proceso. La variación del grado de hidrólisis alcanzado al aumentar la concentración de enzima añadida de 0.94 UA/l a 4.68 UA/l para una concentración constante de sustrato (17.45 g/l) el pH (8.0) y la temperatura (50oC). Los resultados obtenidos permiten apreciar un claro aumento del grado de hidrólisis al aumentar la concentración de enzima que implica un incremento medio del 3.5 % en el grado de hidrólisis al aumentar una unidad la concentración de enzima. La variación del grado de hidrólisis alcanzado al aumentar la concentración de sustrato en el reactor de 3.45 g/ a 32.1 g/l manteniendo constante la concentración de enzima (2.81 UA/l), el pH (8.0) y la temperatura (50oC). Los resultados obtenidos indican una clara disminución del grado de hidrólisis al aumentar la concentración de sustrato: El grado de hidrólisis varía desde un 20,82 % para una concentración de 32,10 g/l hasta un 42,49 % obtenido cuando la concentración inicial de sustrato es 3,45 g/l, pasando por valores intermedios para cada una de las concentraciones utilizadas. Según esto, un aumento de nueve veces de la concentración de sustrato ha provocado una disminución del grado de hidrólisis en torno al 50 % cuando la concentración inicial de enzima se mantiene constante. Consecuencia del diferente comportamiento en ambos casos, es la evolución en la cantidad de productos generados. En el caso de la concentración inicial de enzima existe un claro aumento del porcentaje de proteína solubilizada y lípidos recuperados con el aumento de Eo. Ese comportamiento es consecuencia del aumento de enlaces hidrolizados que se traduce en un aumento de la solubilidad de la proteína. En el caso de la concentración inicial de sustrato ocurre lo contrario ya que el número de enlaces peptídicos rotos es inferior. En cuanto a la cantidad de colágeno recuperada (cantidad de colágeno que permanece sin hidrolizar en el residuo no solubilizado). El colágeno es una proteína fibrosa cuyo comportamiento frente a la hidrólisis es diferente al de las proteínas globulares. Mientras éstas son más fácilmente hidrolizables dadas sus características, el colágeno es menos soluble y más difícil de hidrolizar en su estado nativo lo que hace que su grado de hidrólisis difiera del de las otras proteínas que constituyen los residuos cárnicos. El hecho de que el colágeno sea más difícil de hidrolizar hace que, aunque una parte se haya hidrolizado, haya otra parte que permanece sin hidrolizar en la fase sólida y puede recuperarse para aplicaciones industriales. Por lo tanto, se deduce la que a mayor concentración de enzima (mayor el grado de hidrolisis) mayor será la cantidad de proteína solubilizada, mayor la cantidad de lípidos recuperados y menor la cantidad de colágeno recuperado y a mayor concentración de sustrato (mayor será el grado de hidrolisis) menor será la cantidad de proteína solubilizada, menor la cantidad de lípidos recuperados y mayor será la cantidad de colágeno obtenido, todo esto por acción enzimática. El hecho de que, en contra de lo que cabía esperar, una mayor cantidad de sustrato no generara una mayor cantidad de hidrolizado, nos llevó a pensar que el problema podía estar en una cantidad insuficiente de enzima para las cantidades de sustrato utilizadas ya que, en los ensayos, se utilizó siempre la misma concentración de enzima. Esto implicaría que el parámetro regulador del proceso no serían la concentración de enzima o la concentración de sustrato sino la relación entre ambas. Para comprobar esto, se realizaron unas experiencias para diferentes concentraciones de enzima y de sustrato, pero en las que se mantuvo constante la relación entre ambas. Para cada uno de ellos, el grado de hidrólisis alcanzado fue el mismo independientemente de la concentración de enzima o de la concentración de sustrato que se hubieran utilizado, lo que confirmaba que la variable que rige el proceso es la relación entre la concentración de enzima y la de sustrato. Teniendo esto en cuenta se hizo el estudio para esta relación, trabajando con valores comprendidos entre 0.05 y 0.81 UA/g. Teniendo un claro incremento del grado de hidrólisis al aumentar Eo/So que refleja mayor ruptura de enlace peptídicos cuanto mayor es la cantidad relativa de enzima en relación con la de sustrato que genera un mayor número de puntos activos enlazados entre Alcalase y residuo cárnico. Asimismo, la relación directa entre Eo/So con la proteína solubilizada y la cantidad de lípidos recuperados e inversa con la cantidad de sólido no solubilizado y la cantidad de colágeno recuperada cuya explicación es análoga a la indicada anteriormente. Con la variación de Eo/So tampoco hay ninguna variación en el perfil de ácidos grasos de los lípidos separados. En el estudio de la influencia del pH y la temperatura, se trabajó con valores de pH comprendidos entre 7 y 9 y valores de temperatura comprendidos entre 40 y 60oC. Los resultados obtenidos muestran como los pHs elevados y las temperaturas bajas favorecen la hidrólisis produciendo hidrolizados con mayor grado de hidrólisis. El comportamiento frente al pH está justificado por el aumento de la actividad enzimática con este parámetro y la estabilidad de la enzima en el intervalo de pH 7-10. Aunque el comportamiento frente a la temperatura podría parecer que contradice la bibliografía que indica que un aumento de temperatura corresponde a una mayor actividad enzimática, lo cierto es que, la desactivación que se produce con el tiempo al aumentar la temperatura es tan elevada que la eficacia del proceso es mayor a 40oC dado el tiempo que se mantiene la reacción. En cuanto a la recuperación de productos, los pHs elevados y las temperaturas bajas favorecen la hidrólisis produciendo mayor solubilización de la proteína y permitiendo la recuperación de mayor cantidad de lípidos mientras que los pHs bajos permiten recuperar una mayor cantidad de colágeno. Por el contrario, a mayor temperatura, irá disminuyendo la proteína solubilizada, también disminuirá la recuperación de lípidos y aumentará la recuperación de colágeno. Con la variación del pH y la temperatura tampoco se observó ninguna variación en el perfil de ácidos grasos de los lípidos separados. Para determinar la calidad del hidrolizado proteico obtenido se calculó el tamaño medio de los péptidos obtenidos después de la hidrólisis teniendo en cuenta que existe una relación entre la longitud media de la cadena peptídica y el grado de hidrólisis que viene dada por la expresión: LCP=100/GH donde LCP es la longitud media de la cadena peptídica y GH es el grado de hidrólisis expresado en tanto por ciento. Conocida la longitud media de la cadena peptídica se puede determinar la masa molar media (MM) de los péptidos obtenidos multiplicándola por 130: MM=130·LCP La longitud media de la cadena peptídica y masa molar media calculados a partir del grado de hidrólisis para los hidrolizados obtenidos con cada relación Eo/So y en la tabla de la derecha los calculados para los distintos pH y temperaturas ensayados. Para poder utilizar estos hidrolizados proteicos en la industria alimentaria es preciso que tengan fácil digestibilidad y gusto agradable, lo que solo se consigue cuando la masa molar de los péptidos que los componen está dentro de un intervalo determinado. Por ello hay que tener en cuenta que: Los péptidos de elevada masa molar (superior a 6000 Daltons) pueden producir alergias. Los péptidos de masa molar comprendida entre 1000 y 6000 Daltons son amargos. Los aminoácidos libres (masa molar inferior a 200 Daltons) son hiperosmóticos y producen diarrea. Por tanto, la distribución de masas moleculares debe ser lo más estrecha posible, con un alto contenido en di y tripéptidos y masa molar media del orden de 500 Daltons (entre 200 y 1000 Daltons) ya que, de esta forma, desaparecen los problemas de amargor, hiperosmoticidad y no son alergénicos. Teniendo eso en cuenta, los hidrolizados de mejor calidad serían los obtenidos para relaciones de concentraciones proteasa/sustrato proteico entre 0,11 y 0,16 UA/g, pH entre 7,5 y 8,0 de pH y temperatura entre 50 y 55oC de temperatura ya que, con esa relación, la masa molar media del producto final es próxima a 500 Daltons. El segundo bloque de estudios realizados consistió en la hidrólisis enzimática de la fracción lipídica presente en el residuo. En la hidrólisis enzimática de lípidos, la enzima ataca los enlaces lipídicos de la grasa para favorecer la adición de una molécula de agua, formándose ácidos grasos, mono y diglicéridos, sirviendo éstos últimos como nuevo sustrato lipídico susceptible de ser atacado por la enzima. La liberación de ácidos grasos durante el proceso origina un cambio en el pH por lo que, para evitar esta modificación, la reacción debe en un sistema pHestato en el que el pH se mantiene constante por adición de una base. El proceso se ha seguido mediante el grado de hidrólisis (GH´) que, en este caso, se define como el cociente entre el número de moles de ácidos grasos liberados y el número de moles de ácidos grasos totales susceptibles de ser liberados en la muestra El número de moles de ácidos grasos liberados viene dado por los moles de base consumidos en su neutralización, es decir, por el producto del volumen de base consumido B y su molaridad MB, y el número de moles de ácidos grasos totales por el cociente entre la masa de lípidos en la muestra y el peso molecular medio de los ácidos grasos. Se utilizaron cinco enzimas diferentes para realizar la hidrolisis enzimática de la fracción lipídica del sustrato: Lipozyme CALB L, Lipozyme TL 100L, Novocor AD L, Novozym 51032, y Resinase HT. También todas ellas son lipasas comerciales (de Novozymes) pero con distintas características. La elección se ha hecho en función de: - Su origen: fúngico (Resinase, Novozym y Lipozyme TL) o a partir de levaduras (Novocor y Lipozyme CALB). - Y su especificidad respecto al sustrato de tipo éster o triglicérido. Al igual que en el estudio con proteasas, las condiciones de operación para llevar a cabo las hidrólisis han sido las mismas para todas las lipasas con la finalidad de comparar, en idénticas circunstancias, los resultados obtenidos en el proceso: pH 8, temperatura 50oC, agitación 300 rpm, concentración de sustrato lipídico 63,14 g/l y concentración de lipasa 52,44 kLU/l. El razonamiento seguido para utilizar estos valores ha sido el mismo que en el caso de las proteasas. El diferente comportamiento de las enzimas puede justificarse en función de las características de estas, observándose que las lipasas de origen fúngico como Resinase, Novozym y Lipozyme TL resultan más eficaces que las lipasas obtenidas de levaduras como Novocor y Lipozyme CALB. El hecho de que la Resinase sea la lipasa más eficaz en la hidrólisis de los lípidos presentes en los residuos radica en su especificidad para el sustrato ya que es la única específica para triglicéridos. Respecto a los productos obtenidos, el porcentaje de lípidos recuperados es superior cuando se utiliza Resinase dado que el grado de hidrolisis es más elevado lo que indica que se ha liberado una mayor cantidad de ácidos grasos. En consecuencia, la cantidad de residuos no solubilizados menor corresponde también a la Resinase. Por otra parte, al hidrolizarse los lípidos se favorece la liberación de la proteína presente en el residuo, aumentando por ello la cantidad de proteína solubilizada, aunque el incremento no es notable ya que la solubilidad de la proteína es exclusivamente debida a su hidrólisis con el agua ya que las lipasas no favorecen la hidrolisis de la proteína y no hay proteasas en el medio. En cuanto al porcentaje de colágeno recuperado, los resultados obtenidos parecen indicar que es independiente del tipo de lipasa. Dadas las características de éstas últimas, su hidrolisis es más fácil mientras que el colágeno es menos soluble y más difícil de hidrolizar en su estado nativo lo que hace que su grado de hidrólisis difiera del de las otras proteínas que constituyen los residuos cárnicos. El hecho de que el colágeno sea más difícil de hidrolizar y que no haya en el medio proteasas que favorezcan la hidrólisis aumentando así su solubilidad hace que, prácticamente, todo el colágeno permanezca sin hidrolizar en la fase sólida y pueda recuperarse para aplicaciones industriales. Por tanto, la recuperación de proteína y de colágeno apenas se ve afectada por la hidrólisis realizada con las lipasas. La cantidad de ácidos grasos obtenida con las distintas enzimas ensayadas. Esos resultados muestran que las lipasas procedentes de levaduras (Novocor y Lipozyme CALB) son menos eficaces que las lipasas de origen fúngico (Resinase, Novozym y Lipozyme TL) y que la Resinase es la lipasa más eficaz para la producción de ácidos grasos lo que se justifica por su especificidad para hidrolizar sustratos formados por triglicéridos. También se aprecia una relación entre el grado de hidrólisis y la cantidad de ácidos grasos producidos: cuanto mayor es el GH mayor es la cantidad de AGLs. Esta relación es lógica ya que el GH es calculado como la relación entre ácidos grasos libres separados y ácidos grasos totales susceptibles de ser liberados en la muestra. Por estos motivos se optó por la Resinase para realizar los estudios posteriores. En el estudio de la hidrólisis de la fracción lipídica del residuo cárnico con Resinase, también se han llevado a cabo experimentos para distintas condiciones de operación: variando las concentraciones iniciales de enzima entre 17 y 88 kLU/l y la concentración de sustrato entre 12 y 116 g/l, la relación entre ambas entre 0,2 y 1,2 kLU/g, el pH entre 7 y 9 y la temperatura entre 40 y 60oC. La concentración de residuo cárnico puesta en el reactor, el pH y la temperatura se fijaron en el mismo intervalo que en los estudios con proteasa ya que posteriormente se iba a realizar el estudio conjunto de proteasa y lipasa. La duración de las hidrólisis se fijó en un tiempo de cuatro horas por el mismo motivo tras observar que en el intervalo entre la tercera y la cuarta hora el grado de hidrólisis apenas variaba un 3 %. La evolución del grado de hidrólisis con la concentración inicial de Resinase presenta una tendencia asintótica, alcanzando el GH máximo con una concentración de enzima de 87,44 kLU/l lo que indica que se ha alcanzado la saturación con la enzima. Para este nivel de enzima, un incremento adicional de la concentración de biocatalizador no aumenta la velocidad de reacción por lo que concentraciones de enzima superiores son innecesarias. Este resultado parece recomendar la utilización de concentraciones de enzima entre 70 y 80 kLU/l para evitar desembolsos económicos injustificados. Como se puede apreciar en el caso de la concentración de sustrato lipídico, al contrario de lo que ocurría en la hidrólisis de la fracción proteica del residuo, los resultados son coherentes con el hecho de que, a mayor concentración de sustrato manteniendo la concentración de lipasa constante, se obtenga un mayor grado de hidrólisis, lo que parece indicar que no existe inhibición por sustrato y que la cantidad de lipasa añadida es suficiente para hidrolizar los enlaces lipídicos en todos los casos: no hay defecto de enzima como ocurría en el estudio con Alcalase. Si bien con la Resinase no se han observado resultados diferentes a los previstos en los estudios por separado sobre la influencia de la concentración inicial de lipasa (Eo´) y de sustrato lipídico (So´), con el fin de realizar una análisis sistemático que permita determinar si también en este caso se puede sustituir la influencia independiente de Eo´ y So´ por la relación entre la concentración inicial de lipasa y la concentración inicial de sustrato lipídico (Eo´/So´), se llevó a cabo la determinación de la influencia de este parámetro sobre el grado de hidrólisis y la obtención de subproductos de mayor valor añadido. A partir de los resultados obtenidos aumenta el grado de hidrólisis al aumentar Eo´/So´ indicando una mayor ruptura de enlaces lipídicos al incrementar la cantidad relativa de enzima en relación con la de sustrato ya que se genera un mayor número de puntos activos enlazados entre la Resinase y la fracción lipídica del residuo cárnico. La relación existente entre las variables estudiadas y el grado de hidrólisis alcanzado, tanto en el caso de las proteasas como en el de las lipasas, permite establecer una relación entre el grado de hidrólisis y las cantidades de productos obtenidos de modo análogo a como se establece entre los valores de las variables y esas cantidades de productos. Como era de esperar, existe una relación directa entre el grado de hidrólisis alcanzado y la cantidad de lípidos separados ya que el grado de hidrolisis indica el porcentaje de ácidos grasos liberados. Por otra parte, se comprueba lo que ya se comentó anteriormente: al aumentar la cantidad de lípidos hidrolizados se libera la proteína que tiene por ello la posibilidad de solubilizarse, aunque el incremento de proteína solubilizada no es notable ya que la solubilidad de la proteína es exclusivamente debida a su hidrólisis con el agua ya que las lipasas no favorecen la hidrolisis de la proteína y no hay proteasas en el medio. En cuanto al porcentaje de colágeno recuperado, los resultados obtenidos confirman que es independiente del grado de hidrólisis de la fracción lipídica del residuo por ser una proteína fibrosa difícilmente hidrolizable, especialmente, si no hay una proteasa en el medio. De acuerdo con estos resultados, para recuperar mayores porcentajes de lípidos o proteína solubilizada, deberán utilizarse relaciones de Eo´/So´ altas correspondientes a concentraciones de lipasa altas o de sustrato bajas, mientras que la relación Eo´/So´ no influye en el porcentaje de recuperación de colágeno. Comparando los GH´ obtenidos con las cantidades de cada ácido producidas también tiene una relación directa: a mayor GH´, mayor cantidad de ácido producido. Como ya se indicó anteriormente, esta relación es lógica ya que el GH´ es calculado como la relación entre ácidos grasos libres separados y ácidos grasos libres en la muestra. De esas figuras se deduce que existe una dependencia lineal entre la cantidad de ácidos grasos liberados y el grado de hidrólisis que puede expresarse a partir de una expresión del tipo: AGL=a·GH´+b En la tabla se pueden ver los valores de los parámetros a y b y el coeficiente de regresión cuyo alto valor en todos los casos es indicativo del buen ajuste existente. En cuanto a la influencia del pH y de la temperatura, la evolución del grado de hidrólisis con el tiempo para distintos pH. En ella se observa cómo el GH´ varía entre un 69 % para un pH de 7,0 hasta un 98 % para un pH de 9,0. La tendencia asintótica de esta evolución sugiere que trabajar con pH superiores a 8,5 no implica una mejora significativa en el proceso de hidrólisis de los lípidos. La figura de la derecha, en la que se muestra la evolución del grado de hidrólisis con el tiempo para distintas temperaturas, indica que los grados de hidrólisis finales alcanzados son relativamente próximos entre sí en el intervalo de 40 a 55oC mientras que, para 60oC, el grado de hidrólisis se reduce notablemente. Esto sugiere que no se debe llevar a cabo la hidrólisis lipolítica a temperaturas superiores a 55oC. El comportamiento frente al pH está justificado por la gran estabilidad de la enzima en el intervalo de pH utilizado y, aunque la bibliografía indica que la Resinase es activa a temperaturas de hasta 90oC, se ha comprobado que, en presencia del residuo, se produce desactivación con el tiempo al aumentar la temperatura y esa desactivación es tan elevada a temperaturas más altas que la eficacia del proceso es menor a 60oC dado el largo tiempo que se mantiene la reacción. Los resultados alcanzados en la obtención de subproductos indican que, la recuperación de lípidos y la solubilización de proteínas se ven favorecidas por la reducción de la temperatura o por el incremento del pH, aunque los valores más adecuados parecen estar en torno a un pH de 8,0 ya que, para pHs más altos, no hay variaciones significativas en los porcentajes de subproductos recuperados que justifiquen su empleo. Por otra parte, la recuperación de colágeno en presencia de lipasas parece independiente de las condiciones de operación de pH y temperatura. La justificación de estos resultados está dada por la relación entre el GH´ y el porcentaje de subproductos recuperados que ya se explicó anteriormente. Con el fin de determinar la ecuación cinética que define los procesos de hidrólisis con Alcalase e hidrólisis con Resinase, y comprobada como se ha indicado previamente la clara relación existente entre el grado de hidrólisis y el porcentaje de productos recuperados se optó por seguir la cinética del proceso a través del grado de hidrólisis para lo que se determinó la variación del mismo con el tiempo para distintas concentraciones de enzima, se sustrato, de pH y de temperatura. Las curvas obtenidas se ajustaron por regresión no lineal comprobándose que la variación del grado de hidrólisis con el tiempo puede describirse mediante una ecuación empírica exponencial tipo Elovich en la que la variación del grado de hidrólisis con el tiempo es función de dos constantes cinéticas K1 y K2. Para la determinación de los parámetros K1 y K2, se ha utilizado un programa informático comercial, SPSS, que realiza la regresión no lineal mediante el algoritmo de Levenberg-Marquardt. Con los valores así obtenidos y la ecuación, se han obtenido las líneas que se ajustan perfectamente a la tendencia de los datos experimentales representados con puntos. Las curvas experimentales obtenidas presentan, en todos los casos, una velocidad de reacción inicial muy alta seguida de una notable disminución de la misma con tendencia a un valor límite. La disminución de la velocidad de hidrólisis con el tiempo sólo puede deberse a tres factores: Una disminución en la concentración de los enlaces peptídicos disponibles para la hidrólisis. Una desactivación de la enzima. Una inhibición de la enzima. Con la finalidad de comprobar la existencia o no de enlaces peptídicos susceptibles de ser hidrolizados se añadió a los 60 minutos de hidrólisis, cuando ya la velocidad de hidrólisis había disminuido notablemente, un 25 % de sustrato proteico o lipídico adicional con lo cual, si éste era el factor limitante del proceso, la velocidad de reacción debería haber aumentado notablemente a partir de ese momento, hecho que como puede verse en las figuras no se observó ni en la hidrólisis con Alcalase ni en la hidrólisis con Resinase. Por otra parte, la existencia de este primer factor debería hacer tender todas las curvas en las que se representa el grado de hidrólisis frente al tiempo hacia un límite común determinado por la concentración de enlaces peptídicos susceptibles de ser hidrolizados en el sustrato original, hecho que no se observa en las figuras, lo que parece indicar que éste no es el fenómeno causante de los resultados obtenidos. Para comprobar la existencia o no de desactivación enzimática, se llevó a cabo otro experimento en el que se añadió a los 60 minutos de hidrólisis, nuevamente cuando ya la velocidad de hidrólisis había disminuido notablemente, una cantidad de enzima igual a la inicialmente puesta en el reactor. En este caso sí hubo un aumento de la velocidad de reacción que volvió a ser análoga a la obtenida al principio del proceso lo que indicaba la desactivación de la enzima tanto de la Alcalase como de la Resinase. Para determinar el tipo de desactivación enzimática se representó el grado de hidrólisis (GH) frente al producto de la concentración de enzima y el tiempo (Eot) para una concentración de sustrato constante, obteniéndose una única curva para las distintas concentraciones tanto de Alcalase como de Resinase ensayadas. Para determinar la existencia o no de inhibición enzimática se calculó la velocidad de hidrólisis para distintas concentraciones iniciales de sustrato (que iban de 3 a 35 g/l para la fracción proteica y de 12 y 116 g/l para la fracción lipídica) y para distintos grados de hidrólisis: 5, 10 y 15 %. La Alcalase tiene una clara disminución de la velocidad de reacción con el aumento del grado de hidrólisis y con el aumento de la concentración de sustrato. La disminución de la velocidad de hidrólisis con la concentración de sustrato es indicativa de inhibición por sustrato. Este hecho no resulta extraño ya que hay que recordar que el sustrato utilizado tiene dos componentes principales (el proteico y el lipídico) y existen investigaciones que demuestran que los lípidos son inhibidores del Subtilisin Carlsberg que es el componente principal de la Alcalase 2.4L. Por otra parte, la obtención de velocidades de hidrólisis menores para igual concentración de sustrato proteico al aumentar el grado de hidrólisis es indicativa de un proceso de inhibición, en este caso, por producto. En el caso de la hidrólisis de sustratos proteicos, es bastante habitual encontrar inhibición debido a la formación de péptidos de menor peso molecular. Si se representan los valores la velocidad de reacción obtenidos interpolando para determinados grados de hidrólisis frente a la concentración inicial de sustrato lipídico se puede apreciar cómo la velocidad de reacción aumenta con So´ pero, sin embargo, disminuye con aumento del grado de hidrólisis Este comportamiento es diferente en la hidrólisis del sustrato proteico con Alcalase ya que el aumento de la velocidad de hidrólisis con la concentración de sustrato lipídico indica que, en este caso, no hay inhibición por sustrato, aunque sí parece existir inhibición por producto reflejada en la reducción de la velocidad de reacción con el incremento del grado de hidrólisis. La existencia de inhibición por productos en la hidrólisis de aceites y grasas con lipasas es un fenómeno ya reflejado por otros autores, incluso algunos investigadores han indicado que son los propios ácidos grasos liberados en el proceso los causantes de la inhibición Dado que se ha comprobado la existencia de inhibición por sustrato, producto o ambos, así como desactivación de la enzima, se propone a continuación un mecanismo que incluye estos fenómenos para justificar la ecuación que define la cinética del proceso. Para el caso de la Alcalasa la cinética del proceso puede describirse, por tanto, por medio de cuatro reacciones: Reacción de hidrólisis: en la que, inicialmente, se forma un complejo enzima-sustrato que se descompone, posteriormente, para liberar el producto Reacciones de inhibición de la enzima: la reacción se ve inhibida: a) por los productos formados en la hidrólisis pueden competir con el sustrato proteico. b) por la fracción lipídica del sustrato ya que los lípidos pueden competir con la fracción proteica del sustrato Reacción de desactivación enzimática: el hecho de que se haya comprobado experimentalmente que la desactivación de la enzima disminuye en presencia de sustrato siguiendo una cinética de orden dos parece indicar que en el mecanismo de desactivación interviene el sustrato de modo que el proceso puede venir dado por la reacción entre la enzima libre y el complejo enzima-sustrato. En el caso de la Resinase, la cinética del proceso es análoga, pero se limita a tres reacciones: Reacción de hidrólisis: Etapa de formación del complejo lipasa-sustrato lipídico que se descompone, posteriormente, para liberar el producto Reacción de inhibición de la enzima por los productos: ya que algunos mono o diglicéridos o ácidos grasos, formados en la hidrólisis, pueden competir con el sustrato lipídico Reacción de desactivación enzimática: el hecho de que se haya comprobado experimentalmente que la desactivación de la enzima disminuye en presencia de sustrato siguiendo una cinética de orden dos parece indicar que, al igual que en la hidrólisis del sustrato proteico con Alcalase, en el mecanismo de desactivación interviene el sustrato de modo que el proceso puede venir dado por la reacción entre la enzima libre y el complejo enzima-sustrato Considerando que: La velocidad de hidrólisis está determinada por la etapa irreversible de formación de producto La variación de la concentración del complejo enzima-sustrato ES con el tiempo es despreciable Que, en la hidrólisis con Alcalase, dada la elevada concentración de lípidos en el reactor, predomina la inhibición por sustrato frente a la inhibición por producto. Que, en la hidrólisis con Resinase, el proceso de inhibición por producto no es controlante, sino que predomina la afinidad de la enzima por el sustrato Se llega a las siguientes expresiones para los coeficientes K1 y K2 diferentes para la hidrólisis con Alcalase y la hidrólisis con Resinase, pero en las que se puede observar que, en ambos casos, K1 depende de la concentración inicial de enzima y de sustrato y mientras que K2 solo depende de la concentración inicial de sustrato. A partir de esas expresiones y utilizando los valores de K1 y K2 obtenidos en el ajuste no lineal de las curvas de hidrólisis se puede obtener el valor de las constantes cinéticas del proceso: Constante de velocidad de reacción, constante de desactivación de la enzima, constante de inhibición de la enzima y constante de Michaelis-Menten Puesto que los parámetros K1 están relacionado con la constante de velocidad de reacción y el producto de K1· K2 está relacionado con la constante de desactivación de la enzima, los cambios en K1 y en K1· K2 producidos por la temperatura (T) seguirán la ecuación de Arrhenius donde Aa y Ad son los factores de frecuencia, ΔEa y ΔEd son las energías de activación de la hidrólisis y de desactivación de la proteasa, respectivamente, y R es la constante de los gases, La linealización de las ecuaciones de Arrhenius permite obtener gráficamente el valor de la energía de activación de la hidrólisis enzimática de la fracción proteica y de la fracción lipídica del residuo cárnico con Alcalase y Resinase respectivamente y el valor de la energía de desactivación de esas enzimas en el proceso. ΔEa = - 103,92 kJ/mol ΔEd = - 105,67 kJ/mol ΔEa´ = - 122,89 kJ/mol ΔEd´ = - 133,16 kJ/mol Los valores negativos obtenidos para las energías de activación y desactivación parecen contradecir la ley de Arrhenius. Sin embargo, se ha comprobado que los coeficientes cinéticos disminuyen al aumentar la temperatura de manera que se alcanzan energías de activación o desactivación negativas en diversas situaciones: Procesos que transcurren en varias etapas Procesos con formación de complejos intermedios Procesos producidos en dos etapas: la primera reversible y la segunda irreversible Procesos con desnaturalización de la enzima Todas estas circunstancias están presentes en el estudio realizado ya que, como se ha indicado en el mecanismo que justifica el proceso, éste tiene lugar en varias etapas: una reversible en la que se forma el complejo enzima-sustrato y una irreversible en la que el complejo da lugar al producto liberando de nuevo la enzima desnaturalizada en parte. Estos resultados se ven confirmados por el hecho de que hay antecedentes de energías de activación negativas al utilizar hidrolasas. Con la finalidad de optimizar el proceso obteniendo en una única etapa hidrolizados enzimáticos, colágeno y ácidos grasos, se procedió a realizar experimentos de hidrólisis utilizando como catalizador enzimático una mezcla de Alcalase y Resinase que son las enzimas que han demostrado ser más eficaces en el proceso. Para reducir al mínimo el número de experimentos a llevar a cabo se realizó un diseño de experimentos utilizando el método Taguchi. Dado que, en la hidrólisis con una mezcla de proteasa y lipasa, no es posible el seguimiento del grado de hidrólisis mediante el método del pH-metro utilizado ya que el consumo de NaOH se emplea en neutralizar la subida de pH debida tanto a la formación de grupos carboxílicos por la hidrólisis de proteínas como a la formación de ácidos grasos por la hidrólisis de lípidos, las variables a optimizar seleccionadas han sido: - El porcentaje de proteína solubilizada (que indica la cantidad de hidrolizado proteico producido). - El porcentaje de colágeno no hidrolizado (que indica la cantidad de colágeno que se puede recuperar) - El porcentaje de lípidos separados (que indica la cantidad de ácidos grasos producidos) - El porcentaje de residuo no solubilizado (que indica la cantidad de residuo que deberá llevarse a vertedero a pesar del tratamiento). El tipo de optimización que se ha buscado ha sido “mayor-mejor”, para los porcentajes de solubilización de proteína, de colágeno no hidrolizado y de lípidos separados ya que se quiere obtener la mayor cantidad de productos posible (de hidrolizado proteico, ácidos grasos y colágeno), y “menor-mejor” para el porcentaje de residuo no solubilizado ya que se quiere que quede la menor cantidad de residuo cárncico que haya que llevar a vertedero. A la vista de los resultados obtenidos en los estudios previos con las enzimas por separado, los factores de control seleccionados fueron los que mostraron ser determinantes en el proceso: Relación concentración inicial de proteasa/concentración inicial de sustrato proteico (Eo/So). Relación concentración inicial de lipasa/concentración inicial de sustrato lipídico (Eo´/So´). pH. Temperatura. No se ha considerado la influencia del tiempo de hidrólisis ya que, según resultados de estudios anteriores es imprescindible un tiempo mínimo de tres horas para llegar a los valores máximos de transformación del sustrato que apenas varían en el transcurso de la hora siguiente. Por ello, el tiempo de hidrólisis se ha mantenido en 240 minutos. Cada uno de los factores seleccionados fueron modificados dentro de unos ciertos límites (niveles). Todos los factores fueron estudiados a 3 niveles. Los niveles se seleccionaron en el intervalo en el que se conseguía la relación más adecuada entre la cantidad de hidrolizado proteico producida, la cantidad de colágeno sin hidrolizar, la cantidad de ácidos grasos producida y la cantidad de residuo sin solubilizar. Los valores seleccionados fueron los siguientes: Para la relación Eo/So, los niveles de esta relación estuvieron entre 0,11 y 0,21 UA/g, valores que, de acuerdo con los estudios previos, permitían obtener hidrolizados proteicos con un peso molecular adecuado para su uso en la industria alimentaria. Para la relación Eo´/So´, los niveles de esta relación se fijaron entre 0,55 y 1,11 kLU/g, ya que, según los estudios previos, en ese intervalo se obtenían cantidades elevadas de ácidos grasos libres sin encarecimiento innecesario del proceso. Para el pH y la temperatura, los tres niveles considerados se encontraron entre 7,5 y 8,5 y entre 45 y 55oC, respectivamente, valores para los que se obtenían cantidades elevadas de hidrolizado proteico, colágeno y ácidos grasos sin un coste excesivo de acuerdo con los estudios previos. Mediante la metodología Taguchi se utilizó un arreglo ortogonal L9, que permite estudiar 4 factores a 3 niveles mediante 9 experimentos. Con la finalidad de comprobar si la realización de la hidrólisis con mezclas de Alcalase y Resinase y los efectos combinados de las variables del proceso podían haber modificado la tendencia de las variables estudiadas respecto a lo observado con las enzimas individualmente, se realizaron tres tipos de análisis: un análisis individual de los factores de control, un análisis del índice Señal/Ruido y un análisis de superficies de respuesta. Comenzaremos comentando los resultados del estudio de la influencia factores individuales. En el estudio de la influencia de la relación entre la concentración de Alcalase y la concentración de sustrato proteico (Eo/So) se observó que: El porcentaje de lípidos recuperados indicativo de los ácidos grasos liberados obtenido se incrementa al aumentar el valor de Eo/So de 0,11 a 0,16 UA/g valor a partir del cual el porcentaje de varía en menor grado En el porcentaje del hidrolizado proteico, indicativa de la cantidad de hidrolizado proteico producido, se aprecia que un aumento del valor de Eo/So de 0,11 a 0,21 UA/g genera un incremento lineal en el porcentaje de proteína solubilizada Para el porcentaje de colágeno no hidrolizado, se observa el efecto opuesto: se aprecia un claro aumento del porcentaje de colágeno al disminuir Eo/So de 0,21 a 0,11 UA/g El porcentaje de residuo no solubilizado obtenido es inferior al 10 % para todos los valores de Eo/So analizados, siendo los valores más altos para 0,11 UA/g y disminuyendo en el intervalo de 0,16 a 0,21 UA/g En el estudio de la influencia de la relación entre la concentración de Resinase y la concentración de sustrato lipídico (Eo´/So´) se apreció que: Existe una tendencia al aumento del porcentaje de lípidos recuperados y de proteína solubilizada en el intervalo de 0,55 a 1,11 kLU/g Mientras que en el caso del porcentaje de colágeno no hidrolizado y de residuos no solubilizados ocurre lo contrario en ese mismo intervalo de 0,55 a 1,11 kLU/g En el caso del pH: La recuperación de lípidos sigue una tendencia irregular. Se observa un cierto descenso entre pH = 7,5 y pH = 8,0 y un ligero aumento para pH = 8,5 En la solubilización de proteínas este comportamiento es mucho más marcado observándose en general, para pH = 8,0, los valores más bajos En el porcentaje de colágeno no hidrolizado, la tendencia también es bastante irregular, aunque parece mostrar un valor ligeramente mayor para el valor de pH intermedio analizado. Análogo efecto se aprecia en el porcentaje de residuo no solubilizado en el que, sin haber claras variaciones, podría considerarse que el pH de 8,0 genera una mayor cantidad de residuos. Respecto a la temperatura Su efecto sobre el porcentaje de lípidos recuperados es reducido, permaneciendo ese porcentaje más o menos contante en todo apreciándose un reducidísimo incremento a 50oC El porcentaje de proteína solubilizada a la temperatura es diferente, observándose un valor medio más o menos constante para 45-50oC y una disminución a temperaturas superiores En el porcentaje de colágeno no hidrolizado y en el de residuo no solubilizado, el efecto es bastante irregular Con el fin de observar con más claridad el efecto de cada factor sobre las variables a optimizar, se ha estudiado la relación señal/ruido (Signal to Noise) (S/N). Como se ha indicado previamente, para los porcentajes de solubilización de proteína, de colágeno no hidrolizado y de lípidos separados la relación S/N se calculó utilizando criterios de "mayor-mejor" Y para el porcentaje de residuo no solubilizado la relación S/N se calculó utilizando criterios de "menor-mejor" En esas ecuaciones S/N es la relación señal/ruido, n es el número de pruebas en un experimento e yi es la respuesta experimental a la i-repetición. Independientemente del criterio utilizado para optimizar la función objetivo de S/N (mayor-mejor, menor-mejor, nominal-mejor, etc.) la manera de interpretar los resultados siempre es la misma: cuanto mayor sea el valor de la relación S/N, mejor será el resultado obtenido. Partiendo de esos criterios de optimización se obtiene, para cada factor estudiado, un rango de valores para la relación S/N de modo que un rango mayor significa una mayor influencia de ese factor respecto a los demás en las variables a optimizar seleccionadas. Los resultados obtenidos para la proteína solubilizada, los lípidos recuperados, el colágeno no hidrolizado y el residuo no solubilizado. Los resultados obtenidos con la mezcla de enzimas dan unos resultados ligeramente diferentes de los obtenidos con las enzimas individualmente. La relación concentración de Alcalase/concentración de sustrato proteico (Eo/So) es el factor que tiene mayor influencia en todos los casos, ya que un cambio en el factor causa un impacto mayor en la variable estudiada, dando como resultado un mayor rango de la relación S/N El segundo factor más influyente resulta ser la relación concentración de Resinase/concentración de sustrato lipídico (Eo´/So´) en todos los casos excepto en el del residuo en el que el pH tiene una importancia análoga La temperatura, sin embargo, muestra ser un factor muy poco influyente en todos los casos Teniendo esto en cuenta el orden de influencia de los factores controlantes para obtener una mayor cantidad de productos y una menor cantidad de residuo para llevar a vertedero será: Eo/So, Eo´/So´, pH y temperatura. Con la mezcla de Alcalase y resinase la producción de hidrolizado enzimático y ácidos grasos se ve favorecida por relaciones Eo/So y Eo´/So´ altas ocurriendo lo contrario para el colágeno no hidrolizado lo que concuerda con los resultados obtenidos con las enzimas por separado. Sin embargo, se observa que, al trabajar con la mezcla de enzimas, la influencia del pH y de la temperatura son mucho menores que cuando se trabaja con las enzimas individualmente mostrando también una tendencia diferente. Con la finalidad de evaluar la influencia no solo de los parámetros individuales sino también de sus interacciones, así como llevar a cabo la optimización de las condiciones de hidrólisis se utilizó el método de superficie de respuesta. Para ello se hizo un ajuste cuadrático con interacción de variables para obtener una ecuación que relacione cada una de las variables a optimizar con los factores de control examinando posteriormente la ecuación obtenida en función de un análisis de varianza ANOVA para el modelo experimental empleado. El análisis de varianza ANOVA permite decidir qué factores o interacciones son más significativos en el ajuste de la variable de respuesta y si el modelo es adecuado para describir la variable de respuesta representando adecuadamente una correlación entre las variables estudiadas. Se ha utilizado el diagrama de Pareto o de efectos estandarizados como expresión gráfica de los resultados del test ANOVA. Los ajustes realizados se corresponden con ecuaciones del tipo de la que aparece en la pantalla donde el tanto por ciento (%) representa el porcentaje de la variable analizada (proteína solubilizada, lípidos recuperados, colágeno no hidrolizado o residuo sin solubilizar) y a, b, c, d, etc. son coeficientes que varían con la variable analizada. Los elevados valores de F y la probabilidad de 0,00 < 0,05 obtenidos en todos los casos implican que el modelo es significante, lo que indica que la ecuación del modelo describe apropiadamente la superficie de respuesta con respecto a la variable analizada en el intervalo de la investigación. En los diagramas de Pareto se puede ver que: Los términos del modelo significativos que tienen mayor efecto en las variables de respuesta son las relaciones enzima/sustrato, el pH, sus cuadrados y sus interacciones siendo el resto de los términos y sus interacciones no significativos. Dentro de los términos significativos, los que más influencia tienen difieren en función de la variable analizada. Así: En el porcentaje de proteína solubilizada son la relación entre proteasa y sustrato proteico, su cuadrado y la interacción entre la relación lipasa y sustrato lipídico con el pH. En el porcentaje de lípidos recuperados son la interacción entre las relaciones enzima/sustrato y el cuadrado de la relación proteasa/sustrato proteico. En el porcentaje de colágeno no hidrolizado son la relación proteasa-sustrato proteico y su cuadrado. En el porcentaje de residuo no solubilizado el cuadrado de la relación proteasa/sustrato proteico y su interacción con la relación lipasa/sustrato lipídico. La bondad del ajuste se ha comprobado mediante una representación de los valores del parámetro correspondiente calculados a partir de la ecuación frente a los observados experimentalmente en la que se obtienen rectas de pendiente próxima a 1 en todos los casos y con coeficientes de determinación superiores al 95 %. Los valores obtenidos para el coeficiente de determinación indican, de nuevo, que el modelo es adecuado para describir la variable de respuesta y representa convenientemente una correlación entre las variables de estudio. Además, señala que el más del 95 % de la variabilidad es explicada por el modelo y menos del 5 % no lo es o fue un resultado de la casualidad. Una vez se tienen las ecuaciones que ligan los parámetros analizados con las variables de proceso, se puede optimizar el valor de la superficie de respuesta. En las figuras aparecen las gráficas de superficie de respuesta y de contorno de los parámetros estudiados combinando de dos en dos las variables d proceso para el caso del porcentaje de proteína solubilizada. Al examinar las gráficas la superficie donde se maximiza el porcentaje de proteína solubilizada que aparece en color verde oscuro en las gráficas de contorno. Partiendo de los resultados obtenidos en las gráficas de superficie y de contorno, se ha optimizado el proceso para obtención de una producción de hidrolizado lo mayor posible siendo el objetivo conseguir un porcentaje de proteína solubilizada máximo, es decir, del 100 %. La gráfica de optimización de respuesta permite determinar las condiciones óptimas de operación para conseguir ese 100 % de proteína solubilizada. De modo análogo se hicieron los estudios para los demás parámetros estudiados, optimizando para obtener un 100 % de lípidos recuperados, o un 100 % de colágeno no hidrolizado o un 0 % de residuo no solubilizado destinado a vertedero. A partir de las ecuaciones propuestas pueden fijarse las condiciones de operación para obtener las cantidades deseadas de productos en función de obtener el mayor beneficio posible por su venta. Con la finalidad de calcular ese beneficio, se ha realizado la evaluación económica del proceso. Una vez comprobado que el coste de Alcalase y Resinase era menor que el coste de las otras enzimas ensayadas teniendo en cuenta su coste por unidad de actividad y el grado de hidrólisis alcanzado con ellas, se procedió a calcular la rentabilidad del proceso tomando como referencia 1 kg de residuo cárnico a tratar. Los costes de tratamiento (CT) se pueden dividir en costes de la etapa de reacción (CER) y costes de la etapa de separación y purificación de productos (CES) No se han incluido los costes de pretratamiento correspondientes a la etapa de molienda y tamizado del residuo antes de su utilización en el reactor porque son despreciables. El coste de la etapa de reacción (CER) se ha calculado a partir de la suma del coste de los reactivos y los catalizadores (CR) y del coste calorífico (CC) que implica la hidrólisis A parte del residuo y el agua necesaria para llevar a cabo la hidrólisis, es necesario añadir enzimas para que la reacción se desarrolle e hidróxido de sodio para controlar el pH, tal y como ya se ha explicado en las secciones anteriores. El coste del hidróxido de sodio y del agua es despreciable frente al de la enzima por lo que el coste de la partida de reactivos y catalizadores (CR) se puede expresar a partir de las unidades de actividad de las enzimas usadas en el tratamiento y su precio. Las unidades de actividad se calculan por el producto de la concentración inicial de enzima y el volumen: Dado que el proceso se lleva a cabo a temperaturas superiores a la temperatura ambiente, la partida del coste calorífico incluye el coste de calentar el agua hasta la temperatura de reacción y de mantener esa temperatura durante el tiempo de duración de la hidrólisis. Como combustible se propone utilizar gas natural. El consumo de gas se calcula por el cociente entre el calor necesario para el proceso (Q) y el poder calorífico de dicho gas (PCI). El coste calorífico de cada tratamiento será el producto del consumo por el precio en el mercado de dicho gas (pC) De acuerdo con lo indicado anteriormente, el calor implicado en cada tratamiento (Q) se divide en dos términos: el correspondiente al calentamiento de la mezcla reaccionante (QC) y el correspondiente al mantenimiento de la temperatura durante el tiempo de reacción (Qm) El calor correspondiente al calentamiento de la mezcla reaccionante (QC) se puede estimar mediante la siguiente expresión a partir de la masa a calentar, su capacidad calorífica, la temperatura de reacción y la temperatura de entrada de la mezcla reaccionante que se ha fijado en 20oC El calor correspondiente al mantenimiento de la temperatura (Qm) se calcula como la suma del calor que se perdería si el reactor no estuviese encamisado y se le suministrase calor desde el exterior y el calor de reacción Las pérdidas de calor se pueden estimar a partir del coeficiente global de transmisión de calor el área de transferencia de calor el tiempo de reacción la temperatura de reacción y la temperatura ambiente En los cálculos se ha considerado un valor medio de 20oC para la temperatura ambiente y el tiempo de reacción se ha fijado en los 240 minutos de duración de los experimentos. El calor de reacción se divide en dos partes: el calor de la reacción de hidrólisis de proteínas y el calor de la reacción de hidrólisis de lípidos Los calores de las reacciones de hidrólisis de proteínas y lípidos se pueden expresar en función de los moles de sustrato que han reaccionado multiplicado por su entalpía de reacción. En el caso del sustrato proteico los moles que han reaccionado se obtienen multiplicando la concentración de sustrato inicial por el grado de hidrólisis en tanto por uno, por el número de enlaces peptídicos del sustrato y por el volumen de mezcla En el caso del sustrato lipídico los moles que han reaccionado se obtienen multiplicando la concentración de sustrato inicial por el grado de hidrólisis en tanto por uno, por el volumen de mezcla y dividiendo por masa molar media de ácidos grasos en los lípidos del residuo En el caso de las hidrólisis con mezclas de Alcalase y Resinase para las que se va a hacer este estudio económico, no se pudo determinar el grado de hidrólisis tal y como se comentó anteriormente. Sin embargo, dado que se ha comprobado que existe una relación directa entre el porcentaje de proteína solubilizada y el grado de hidrólisis de proteínas y entre el porcentaje de lípidos recuperados y el grado de hidrólisis de lípidos, se ha establecido la ecuación de esas relaciones a partir de los datos obtenidos en los experimentos con Alcalase y Resinase por separado En la tabla se han incluido los valores correspondientes al coste de los ractivos y catalizadores (CR) y al coste calorífico (CC) así como el coste de la etapa de reacción para cada uno de los experimentos realizados con la mezcla de Alcalase y Resinase. De los resultados obtenidos se deduce que el coste de funcionamiento del reactor enzimático está principalmente condicionado por el coste de las enzimas, representando en torno al 95 % del coste total de la etapa de reacción en los experimentos estudiados. Dado que en la presente tesis no se ha llevado a cabo la separación y purificación de los productos individualmente, no se pueden calcular los costes correspondientes. Sin embargo, sí que se pueden estimar ya que, según la bibliografía, los costes de separación y purificación de los productos de la corriente procedente de un representan entre el 60 y el 80 % de los costes de totales de producción. Teniendo esto en cuenta, la situación más conservadora en la que los costes de la etapa de separación y purificación sean un 80 % de los costes totales de producción o tratamiento del residuo y, por tanto, los costes de la etapa de reacción sean solo un 20 %, el valor de los primeros se puede calcular a partir de la expresión Los ingresos generados radican en la venta de los productos obtenidos: hidrolizado proteico, colágeno y ácidos grasos Los ingresos por venta de los productos se han calculado a partir de la cantidad de cada producto obtenido y el precio de venta del mismo dado por suministradores Para determinar el valor de los ingresos por venta de ácidos grasos se analizó la composición en ácidos grasos en la fase lipídica en miligramos de ácido graso por gramo de lípido calculando, a partir de ella, la cantidad de cada ácido graso liberado en cada experimento. La rentabilidad del proceso (R) se calculó por diferencia entre los ingresos totales por ventas (IT) y los costes de tratamiento (CT ) Los ingresos totales por ventas y los costes de tratamiento obtenidos se han resumido, los resultados obtenidos indican que el tratamiento más rentable, dentro de los elegidos por ser los más adecuados, es el que se lleva a cabo a menor relación proteasa/sustrato proteico, menor relación lipasa/sustrato lipídico, menor pH y menor temperatura ya que con él se obtienen cantidades elevadas de productos recuperados y, sin embargo, los costes de las enzimas y los costes caloríficos son los más económicos. En la tabla también se puede observar cómo, en los experimentos realizados, los beneficios oscilan entre 1 y 2 € por cada kg de residuo de carnicería tratado. Para saber si este valor es aceptable o desaconseja el tratamiento propuesto, se ha comparado con el beneficio actualmente obtenido con la venta de los residuos de carnicería. En la actualidad, el destino de los residuos de carnicería que no van a vertedero es su transformación en harina para alimentación animal. El precio de venta de la harina de carne y huesos está en torno a 0,5 €/kg de harina, y considerando que la harina contiene exclusivamente carne y huesos, es decir que es 100 % residuo, ese precio se puede expresar como 0,5 €/kg de residuo. Teniendo en cuenta que ese es el valor del ingreso por venta al que habría que descontar los costes del proceso de obtención de la harina (que tiene que incluir, como mínimo, secado, molienda y tamizado) el beneficio por venta de la harina obtenida a partir de los residuos de carnicería será inferior a 0,5 €/kg ya que, aunque la molienda y el tamizado tengan un coste despreciable, no ocurre lo mismo con la etapa de secado. De acuerdo con esto se aprecia que el beneficio obtenido en la transformación de los residuos de carnicería en hidrolizados proteicos, colágeno y ácidos grasos sería, en el peor de los casos, tres veces superior al obtenido con la transformación de los residuos de carnicería en harina lo que hace altamente recomendable el tratamiento enzimático propuesto en esta tesis. Además de la alta rentabilidad de dicho proceso, se evitaría también que se llevara a vertedero una gran parte de los residuos de carnicería que a día de hoy todavía se están llevando. Dado que las conclusiones de los estudios realizados: En relación con el sustrato: Los residuos de carnicería resultan ser una buena materia prima para la obtención de productos de alto valor añadido debido a su alto contenido en proteínas y lípidos. La hidrólisis enzimática es un tratamiento adecuado para este tipo de transformación. Respecto a la hidrólisis con las enzimas individualmente: Las variables determinantes del grado de hidrólisis alcanzado en el proceso son: tipo de enzima utilizada, relación entre la concentración inicial de enzima y la concentración inicial de sustrato, pH, temperatura y tiempo de hidrólisis. El grado de hidrólisis alcanzado en el proceso ha resultado ser más determinante en la cantidad de productos obtenidos que el tipo de enzima utilizada. Dentro del intervalo ensayado para las variables de operación, los grados de hidrólisis tanto de la fracción proteica como de la fracción lipídica más elevados corresponden a las relaciones más altas entre la concentración inicial de proteasa y la concentración inicial de la fracción proteica en el sustrato, a los pH más altos y a las temperaturas más bajas. La cinética de la reacción de hidrólisis tanto de la fracción proteica como de la fracción lipídica del residuo de carnicerías ajusta satisfactoriamente a una ecuación tipo Elovich. El mecanismo de la reacción propuesto para justificar esa ecuación, de acuerdo con los resultados obtenidos, corresponde a un proceso de hidrólisis enzimática con desactivación enzimática de orden dos e inhibición por producto a la que se añade inhibición por sustrato en el caso de la hidrólisis de la fracción proteica. Respecto a la hidrólisis con las enzimas conjuntamente: La metodología Taguchi aplicada para el diseño factorial de experimentos seleccionando tres niveles para cada uno de los cuatro factores de control estudiados (arreglo ortogonal L9) ha resultado totalmente adecuada para el estudio. Las variables de operación (factores de control), que resultan ser controlantes, son la relación entre la concentración inicial de proteasa y la concentración inicial de sustrato proteico (Eo/So), la relación entre la concentración inicial de lipasa y la concentración inicial de sustrato lipídico (Eo´/So´), el pH y la temperatura. El estudio del índice señal/ruido, el análisis de varianza ANOVA para el ajuste cuadrático con interacción de variables utilizado como modelo experimental y las gráficas de superficies de respuesta y de contorno permiten determinar las condiciones de operación óptimas para alcanzar los valores deseados de las variables objetivo. En cuanto a la evaluación económica: De las enzimas ensayadas, las más económica en cuanto a relación coste-rendimiento alcanzado en el proceso han sido Alcalase y Resinase. Los costes de la etapa de reacción están fundamentalmente determinados por el coste de las enzimas. Los costes de la etapa de separación y purificación de productos son cuatro veces superiores a los costes de la etapa de reacción. El coste de tratamiento (suma de costes de las etapas de reacción y separación y purificación de productos) oscila entre 1,65 y 3,20 € por kg de residuo de carnicería tratado en las condiciones de operación analizadas. En los experimentos analizados, los ingresos por venta de hidrolizado proteico oscilan entre 1,30 y 1,85, los ingresos por venta de colágeno no hidrolizado oscilan entre 0,40 y 0,55 y los ingresos por venta de ácidos grasos oscilan entre 1,60 y 2,20 €/kg de residuo de carnicería tratado El beneficio obtenido por venta de los productos obtenidos a partir del tratamiento enzimático con mezcla de proteasa y lipasa oscilan entre 1 y 2 € por cada kg de residuo de carnicería tratado. El beneficio económico obtenido en el tratamiento de los residuos de productos cárnicos destinados al consumo humano con mezclas de proteasa y lipasa para la producción de hidrolizado proteico, colágeno no hidrolizado y ácidos grasos es, en las condiciones más desfavorables de operación, tres veces superior al obtenido con la transformación habitualmente usada de esos residuos en harina lo que hace altamente recomendable el tratamiento enzimático propuesto en esta tesis.