In-depth analysis of jasmonate-mediated indole-3-acetic acid (IAA) biosynthesis and its implication in plant development

Resumen

Indole-3-acetic acid (IAA), the main naturally occurring auxin in plants, is an essential plant hormone that has been associated with the regulation of many aspects of plant development and growth. However, despite auxin biology is one of the classical fields of plant research, its biosynthesis, spatio-temporal regulation, molecular action and the crosstalk with other hormones remain uncertain. Actually, although multiple pathways are proposed for auxin biosynthesis, many previous genetic and biochemical studies revealed that the indole-3-pyruvic acid (IPA) pathway is the main source of IAA in plants. This pathway involves the action of two classes of enzymes, tryptophan-pyruvate aminotransferases (TRYPTOPHAN AMINOTRANSFERASE OF ARABIDOPSIS 1 (TAA1)/TRYPTOPHAN AMINOTRANS-FERASE RELATED (TAR)) and flavin monooxygenases (YUCCA). Among these families, the presence of the YUCCA genes in multiple plant genomes point out and essential role in biosynthesis and plant development. Current evidences indicate that exogenous application of methyl jasmonate (MeJA) or endogenous production of jasmonic acid (JA), a hormone with a prevalent role in plant defense to necrotrophic pathogens and insect herbivores, is sufficient to trigger IAA biosynthesis through the up-regulation of YUCCA8 and YUCCA9. The work described in this thesis aims at the elucidation of the molecular auxin action by in-depth analysis of 35S::YUCCA8 (YUC8ox) and 35::YUCCA9 (YUC9ox) Arabidopsis transgenic lines, which overproduce IAA. To this end we carried out histochemical analyses and quantitative lignification assays. These analyses allow us to finally determine that the overproduction of auxin cause an abnormal secondary growth, mainly characterized by a stimulated xylem and interfascicular fibers differentiation, as well as increased lignification, which is enriched in H-lignin deposition. Moreover, whole-genome transcriptomic analysis comparing YUC8ox and YUC9ox to wild-type Col-0 plants, revealed a cluster of up-regulated genes capable of modifying cell wall properties. Among those a group of XYLOGLUCAN ENDOTRANSGLYCOSYLASE/HYDROLASE (XTH) genes peaked out. Furthermore, when we analyzed the chemotype of the overexpression lines, we discovered significantly increased levels of ethylene (ET), a gaseous plant hormone with a prominent role in cell division. In conclusion, the results presented here highlight the importance of the hormonal cascade JA-IAA-ET in plant development. We propose a mechanistic model in which the activation of IAA production mediated by JA-induced YUCCA8 and YUCCA9 enzymes, stimulate or inactivate the production of ET to regulate vascular cell division or epidermal cell expansion in a tissue-specific manner. In addition, considering the observed down-regulation of different chitin and water deficit responses genes in the studied YUC8/9ox lines, we determine that the JA-IAA crosstalk is an on-off “switch” mechanism to fine-tune the balance between growth and defense processes. The physiological aspects underlying the IAA-ET induced secondary growth and cell expansion have been also unveiled in this thesis. Our results show that YUCCA8 and YUCCA9 mediate a positive defense response against the herbivore Tetranychus urticae, as well as, an improved drought tolerance for YUC9ox, thereby underlining a role of JA-IAA-ET in plant response. Finally, this thesis strives to shed light on the molecular relationship that share these two seemingly antagonistic hormones, jasmonic acid and auxin. Herein, we analyzed different mutants defective in known jasmonate-induced transcriptional factors. Our transient expression analysis in Nicotiana benthamiana and Arabidopsis protoplasts clearly demonstrate that MYC2, as well as its closest homologs MYC3 and MYC4, function as a transcriptional regulators of YUCCA8 and YUCCA9 through its direct binding to different G-boxes located at the promoter of the mentioned YUCCA genes. This study provides for the first time a molecular proof that links jasmonic acid signaling with auxin biosynthesis.   Resumen El ácido-3-indol-acético (AIA) es la auxina principal presente en las plantas. Esta hormona vegetal regula diversos procesos fisiológicos, siendo esencial para el correcto crecimiento y desarrollo de las plantas. Sin embargo, a pesar de que el estudio de esta auxina es uno de los campos de estudio más antiguos en biología vegetal, algunos aspectos de su biosíntesis, regulación espacio-temporal, mecanismos moleculares de acción, así como la interacción con otras hormonas, está aún por determinarse. En la actualidad, aunque se han descrito diversas rutas para la biosíntesis del AIA, el desarrollo de numerosos estudios bioquímicos y genéticos ha permitido determinar que la ruta del indol-3-piruvato (IPA) es la principal fuente de producción de AIA en plantas. La biosíntesis de AIA por la ruta metabólica del IPA comprende la acción consecutiva de dos clases de enzimas, las triptófano-piruvato aminotransferasas (TRIPTOFANO AMINOTRANSFERSA DE ARABIDOPSIS1 (TAA1)/TRIPTOFANO AMINOTRANSFERAS RELACIONADAS (TAR)) y las monooxigenasas dependientes de flavina (YUCCA). Entre estas familias, los genes YUCCA muestran una amplia distribución, siendo posible encontrarlos en diferentes genomas de plantas. Este hecho remarca el importante papel que dichos genes desempeñan, no sólo en lo relativo a la biosíntesis de la AIA, sino también en el desarrollo vegetal. Por otro lado, estudios recientes indican que la aplicación exógena de metil jasmonato (MeJA) o la producción endógena de ácido jasmónico (JA), una fitohormona implicada en la regulación de la respuesta de defensa frente a patógenos necrótrofos e insectos herbívoros, es suficiente para estimular la producción de AIA a través de la activación transcripcional de los genes YUCCA8 y YUCCA9. El trabajo descrito en esta tesis tiene como objetivo elucidar los mecanismos moleculares de acción de la auxina mediante la caracterización detallada de las líneas transgénicas de Arabidopsis 35S::YUCCA8 (YUC8ox) y 35S::YUCCA9 (YUC9ox), las cuales son sobreproductoras de AIA. Para lograr el objetivo planteado, se han realizado análisis histoquímicos, así como ensayos de cuantificación de la lignina. En concreto, se ha demostrado que un aumento exagerado de la producción de auxina da lugar a un crecimiento secundario anormal, en el cual se ha observado tanto una diferenciación del xilema y fibras interfasciculares, así como una lignificación, ambas altamente estimuladas. Igualmente, la caracterización de la composición de la lignina ha permitido determinar la alta deposición de unidades de lignina tipo H. Además, el desarrollo de microarrays comparando plantas Col-0 (silvestre) con las líneas transgénicas YUC8ox y YUC9ox, ha permitido revelar un incremento en la expresión en un grupo de genes implicados en la regulación de procesos asociados con la modificación de la pared celular de las plantas. Entre los genes encontrados, los conocidos como XILOGLUCANO ENDOTRANSGLICO-SIDASA/HIDROLASA (XTH) fueron particularmente relevantes. Así mismo, se ha corroborado que las plantas YUC8ox y YUC9ox presentan un incremento en los niveles de etileno (ET), una hormona gaseosa implicada en la regulación de la división celular. En conclusión, los datos presentados en este trabajo demuestran la importancia de la cascada hormonal JA-AIA-ET en el desarrollo de las plantas y desvelan un modelo de acción en el cual la activación de las enzimas YUCCA8 y YUCCA9 por JA estimula la producción de AIA, lo cual induce o inhibe la biosíntesis de etileno en determinados tejidos para regular la división celular en el cambium o la expansión celular en la epidermis. Además de esto, considerando la inactivación de la expresión en genes de respuesta a quitina y sequía, el presente estudio permite determinar que la interacción establecida entre JA y AIA actúa como mecanismo interruptor “encendido-apagado” en el balance entre crecimiento y defensa. Por otro lado, el trabajo de investigación aquí presentado ha estudiado los aspectos fisiológicos subyacentes al crecimiento secundario estimulado por la acción conjunta de IAA-ET. Se ha observado que tanto YUCCA8 como YUCCA9 confieren resistencia frente al ácaro herbívoro Tetranychus urticae, igualmente se ha visto que las plantas YUC9ox presentan mayor tolerancia a estrés por sequía, de esta manera estos resultados demuestran el papel esencial que desempeña la triple interacción JA-AIA-ET en la respuesta de las plantas a estrés. Finalmente, el mecanismo molecular por el cual interaccionan estas dos hormonas aparentemente antagonistas, ácido jasmónico y auxina, ha sido también dilucidado durante la realización de este estudio. Con este fin, se han analizado diferentes mutantes defectivos en varios factores de transcripción dependientes de jasmonato. Mediante ensayos de expresión transitoria en Nicotiana benthamiana y en protoplastos de Arabidopsis, se han confirmado que el factor de transcripción MYC2, así como sus dos homólogos más cercanos MYC3 y MYC4, actúan como reguladores transcripcionales de YUCCA8 y YUCCA9 a través de su unión directa a diferentes cajas G, localizadas en el promotor de los genes YUCCA mencionados. La presente tesis doctoral aporta por primera vez una prueba molecular que une la señalización del ácido jasmónico con la biosíntesis de auxinas.