Caracterización de nuevos reguladores que determinen el posicionamiento y la formación de células madre en arabidopsis thaliana

Resumen

Las plantas tienen la capacidad de crecer y desarrollar nuevos tejido y órganos durante toda su vida. Esta capacidad requiere de la generación y actividad de nuevas células madre. Aunque la actividad de las células madre ha sido estudiada no se conocen con exactitud los mecanismos moleculares que gobiernan la generación de nuevas células madre. El objetivo principal de esta tesis ha sido profundizar en estos mecanismos para lo cual se ha usado como modelo de estudio la raíz de la planta modelo Arabidopsis thaliana. Se han llevado a cabo dos aproximaciones distintas, por un lado se han identificado los genes implicados en mantener o dirigir la reprogramación celular para generar células madre pluripotentes usando una estrategia bioinformática. Esta aproximación ha identificado los genes con expresión específica o enriquecida en el periciclo, ya que es este tejido el que se reprograma para generar nuevas células madre de raíces laterales de forma endógena y también el que se puede reprogramar mediante suplementación hormonal y cultivo in vitro para formar masas celulares proliferantes o callos. Esto resulto en una lista de unos 300 genes, los cuales clasificamos por categorías funcionales, centrándonos en el análisis de factores de transcripción (27), ya que estos podrían estar implicados en mantener la expresión especifica en el periciclo y suelen ser elementos clave en las rutas de señalización. Utilizando líneas de perdida de función de estos factores se realizaron estudios que analizaron la capacidad de formación de raíces laterales y de callo para ver que genes afectaban a la pluripotencia celular. Con estos análisis identificamos dos factores reguladores de la pluripotencia durante el desarrollo postembrionario, FUF1 y OBP4. El estudio posterior del factor OBP4 determinó que su sobre-expresión inicia la proliferación del periciclo, presentando este más de una capa. Además la sobre-expresión de OBP4 en experimentos de formación de callo promueve la proliferación celular causando un incremento en el peso del callo que se forma. También caracterizamos su efecto sobre el mutante alf4-1, un mutante afectado en la formación del callo, observando que la sobre-expresión de OBP4 también es capaz de incrementar la formación de callo en el mutante alf4-1. La segunda aproximación que se ha seguido en esta tesis para identificar reguladores de la formación de nuevas células madre ha consistido en la generación de una biblioteca de mutantes con Etil metil sulfonato (EMS) y en la identificación posterior de mutantes afectados en los primeros estadios de formación de raíces laterales según los marcadores pSCARECROW:GFP y pWUSCHEL-RELATED-HOMEOBOX5:YFP. Esta búsqueda resultó en la localización de dos mutantes que afectaban a la formación de células madre en raíz, lo que ocasionaba que estos no formasen raíces laterales. El primer mutante resultó ser un mutante recesivo de pérdida de función que afectaba al gen GNOM y que denominamos gnom-204. Los datos que nos aporta el marcador DR5 nos indicaban falta de expresión en la zona de la raíz conocida como zona de oscilación y un exceso de marcaje en la zona de maduración, indicativa de la formación ectópica de sitios de pre-ramificación. Los sitios de pre-ramificación son el primer proceso de especificación celular asociado con la formación de células madre pluripotentes o células fundadoras de raíces laterales y dependen de la así llamada expresión periódica oscilante de genes en la zona de oscilación. Se ha descrito que la función de GNOM se relaciona con la regulación del tráfico vesicular mediado por la red trans-golgi, función que es necesaria para la actividad de los transportadores de auxinas. La mutación identificada podría permitir analizar la relación entre el tráfico de auxinas y las oscilaciones en futuros experimentos, identificando nuevas funciones de GNOM en la especificación de células madre. El segundo mutante que identificamos, al que nombramos como potent, afecta al gen IAA18 causando una mutación dominante, similar a otras descritas que afectan a otros IAA impidiendo su degradación por auxinas y la falta de señalización de esta hormona. Nuestros resultados muestran que esta mutación causa la activación continua de las oscilaciones en fase, que son las que determinan la especificación de sitios de pre-ramificación y de células fundadoras coincidente con su máximo de expresión. Esta sobre activación de las oscilaciones en potent genera la especificación continua de sitos de pre-ramificación y células fundadoras a lo largo de la raíz. Además, estas células fundadoras están bloqueadas en ese estadio del desarrollo. Tratamientos con la hormona auxina, que no causan reprogramación del periciclo pero que estimulan el desarrollo de células fundadoras, son capaces de conseguir que estas células pasen este bloqueo lo que da como resultado la sobre-producción de raíces laterales en el mutante. Uno de los factores descritos que interaccionan con IAA18 es AUXIN RESPONSE FACTOR (ARF) 7 el cual resulta ser un factor oscilante en anti-fase, es decir cuya expresión esta desplazada en el tiempo un periodo con respecto a los genes en fase. Nuestros resultados indican que su mutante de perdida de función tiene las oscilaciones en fase sobre-activadas, como en el caso del mutante potent, lo que también resulta en la sobre-producción de células fundadoras. Se ha descrito que los factores IAA actúan como represores transcripcionales de los ARF. En esta tesis se ha profundizado en el mecanismo de regulación de las oscilaciones mediado por IAA18 y ARF7 aguas abajo de las auxinas. Hemos observado que la interacción entre IAA18 y potent con ARF7 es dependiente de la concentración de auxinas en el medio, favoreciendo concentraciones crecientes dicha interacción, lo cual ocurriría por interacción directa con la hormona. La dinámica de la interacción tras la aplicación de auxinas ocurre de forma similar a la activación de la expresión del gen oscilante en fase LOB-DOMAIN16, que es además una diana directa de ARF7. Nuestros datos sugieren que las auxinas actuarían de dos formas distintas, en primer lugar, a concentraciones bajas (10 nM) actuarían como inductoras de la interacción entre ambas proteínas de forma relativamente rápida durante la primera hora de exposición, para a continuación causar degradación de IAA18 a las 3 horas, lo que liberaría a ARF7 de la inhibición de IAA18. En potent además observamos que los niveles de proteína ARF7 están reprimidos mientras que los niveles de auxinas han aumentado, lo que sugiere la existencia de un bucle de retroalimentación entre el heterodimero ARF7-IAA18 y auxinas y ARF7 que podrían ser los responsables de mantener el ritmo de las oscilaciones de los genes en fase. Aunque los niveles de la interacción IAA18-ARF7 resultan ser muy bajos y dificultan su estudio si vemos aumentos periódicos que coinciden con el tiempo estimado de las oscilaciones. En segundo lugar cantidades mayores de auxinas (1M) causarían la degradación de IAA18 de forma observable en la primera hora pero la vez su activación transcripcional, de tal forma que se detecta un incremento de la activación en la primera hora, también coincidente con la activación transcripcional de LBD16. Además, la inactivación de IAA18 mediante la tecnología CRISPR-CAS9 resulta en plantas con un menor número de raíces laterales, lo que apoya el papel de IAA18 como regulador de la expresión oscilante de genes, importante para el posicionamiento de raíces laterales. Asimismo, el análisis microscópico de las células fundadoras que se observan en potent muestra variabilidad de tamaños, que nos indican que parecen sufrir divisiones celulares. El análisis de marcadores muestra que estas divisiones tienden a ser simétricas en tamaño y afectan a la polarización de proteínas que normalmente se observa en las divisiones de las células fundadoras. Así, la proteína MAKR4, la cual se sitúa en la membrana entre dos células fundadoras, se encontraba en el mutante situada a ambos lados de la membrana. Finalmente, potent presenta afectada la formación de otros tipos de raíces postembrionarias como son las raíces adventicias, mientras que el mutante arf7-1 no está afectado en este proceso, lo que nos podría estar indicando que IAA18 actúa en la formación de todo tipo de raíces pero que lo haría mediante la interacción con distintos ARF.