Expresión y purificación del alérgeno nativo par j 1 del polen de parietaria judaica. Utilización como herramienta de diagnóstico y motorización de la respuesta al tratamiento con inmunoterapia específica frente a polen de parietaria judaica

Resumen

INTRODUCCIÓN La alergia se define como una respuesta exagerada e inapropiada del sistema inmunitario, a través de anticuerpos o células específicas, frente a agentes externos habitualmente no peligrosos (ácaros, pólenes) o incluso beneficiosos (alimentos), a los que llamamos alérgenos. El reconocimiento del alérgeno por parte de los anticuerpos o células provoca los distintos síntomas y manifestaciones de la enfermedad alérgica. En la actualidad se utilizan extractos completos para diagnóstico y tratamiento procedentes de fuentes alergénicas naturales. Estos contienen los alérgenos mayoritarios, pero también alérgenos minoritarios y material no alergénico, circunstancia que en ocasiones dificulta la actividad biológica de dichos extractos y el ajuste al perfil alérgico del paciente. El diagnóstico molecular, y más concretamente los alérgenos recombinantes, se han convertido en una herramienta cada vez más importante en el diagnóstico (in vivo e in vitro) de los pacientes alérgicos, por utilizar moléculas puras sin otros contenidos minoritarios o no alergénicos, fácilmente cuantificables, que facilitan una mayor exactitud diagnóstica del perfil alérgico del paciente, así como la investigación y la monitorización de la inmunomodulación. La Parietaria judaica es una maleza perteniciente la familia Urticaceae, habitualmente presente en las zonas costeras mediterráneas, donde es un frecuente alérgeno. Tiene un período de polinización largo, extendiéndose desde febrero a octubre aproximadamente. Se han descrito 4 alérgenos en su polen: Par j 1 y Par j 2 que son los mayoritarios y pertenecen a la familia de las LTP (proteínas transportadoras de lípidos), Par j 3 que es una profilina y Par j 4 que es una polcalcina. HIPÓTESIS El alérgeno nativo (nPar j 1) obtenido, mediante tecnología recombinante y cromatográfica utilizadas en este trabajo, a partir de extracto completo de polen de Parietaria judaica, va a ser reconocido por pacientes alérgicos a esta planta. Dicho alérgeno podrá ser utilizado como herramienta de monitorización de la inmunomodulación producida por el tratamiento con inmunoterapia específica frente a ella. OBJETIVO PRINCIPAL 1. Diseñar un procedimiento de purificación y caracterización de nPar j 1 a partir de un extracto completo de polen de Parietaria judaica OBJETIVOS SECUNDARIOS 2. Evaluar el reconocimiento “in vitro” del nPar j 1 obtenido por un “pool” de sueros de pacientes monosensibles a polen de Parietaria judaica. 3. Valorar la utilidad del nPar j 1 como herramienta de monitorización individual de la inmunomodulación producida por la inmunoterapia específica (ITE) frente a polen de Parietaria judaica, en 10 pacientes monosensibles en tratamiento con ITE, estudiando las variaciones en las capacidades fijadoras de IgE e IgG4 específicas a nPar j 1. MATERIAL Y MÉTODOS / RESULTADOS Partiendo de la materia prima del polen de Parietaria judaica se extrajo el ARNm y de éste el ADNc, que fue amplificado. Conociendo las secuencias publicadas del ARNm del Par j 1 se diseñaron 2 oligos (junto a una secuencia codificadora de 6 histidinas) para obtener del ADNc la región codificadora del gen del Par j 1, obteniendo un ADNc de 720 pb. Este ADNc se insertó en plásmido pRSET B para su clonación y este constructo fue transformado en células E. coli DH5α identificándose posteriormente (tras su cultivo) por Colony-PCR la presencia del constructo y del ADNc de 720 pb. Tras ellos se secuenciaron los nucleótidos para confirmar la identidad de los genes clonados, y una vez confirmada, se transformaron en células E. coli BL21 (DE3)pLysS para proceder a su expresión y se cultivaron en medio selectivo. De nuevo mediante Colony-PCR se confirmó que los clones recombinantes contenían el alérgeno recombinante de Par j 1 (rPar j 1). Las bacterias se lisaron y fueron realizados un Western-blot con anticuerpos antihistidina para locaizar la proteína, una electroforesis del extracto soluble purificado tras cromatografía de afinidad para conocer su PM, obteniendo una proteína con un PM de aproximadamente 20 kDa y un Western-blot con un pool de sueros de pacientes monosensibles a Parietaria judaica que reconocieron al rPar j 1. Disponiendo de rPar j 1 se procedió a sensibilizar vía SC e IM de forma reiterada,de acuerdo con un protocolo establecido, a conejos New Zeland obteniendo antisuero con anticuerpos policlonales monoespecíficos de tipo IgG frente a rPar j 1. El extracto completo de Parietaria judaica del que se iba a extraer en nPar j 1 se analízó mediante SDS-PAGE observándose la presencia de Par j 1 con un peso aproximado de 14,7 kDa y su reconocimiento por parte del pool de sueros de pacientes monosensibles a Parietaria judaica. Se purificó el antisuero de conejo por cromatografía de afinidad sefarosa-proteína A y una vez fijada la IgG del antisuero en la columna se realizaron 2 pases con el extracto completo de Parietaria judaica. Tras eluir en nPar j 1 del anticuerpo IgG, con el volumen obtenido se realizó una segunda purificación con 2 pases en cromatografía de gel filtración para incrementar la pureza del nPar j 1. Se constató la similitud entre las dos proteínas obtenidas, nPar j 1 y rPar j 1, realizando un Western-blot con el antisuero del conejo y con el pool de sueros de pacientes monosensibles a Parietaria judaica, y mediante un ELISA donde cada suero individualmente reconoció a ambas proteínas. Se determinaron la cuantificación de nPar j 1 del extracto completo de Parietaria judaica y la IgE específica de los pacientes mediante InmunoCAP (siendo todos positivos con resultados ≥ clase 2). Se describieron las características del grupo de 10 pacientes monosensibles a Parietaria judaica que residían en misma área geográfica, con rinitis / rinoconjuntivitis moderada y severa de al menos 1 año de evolución, prick test positivo e IgE específica ≥ clase 2, libres de fármacos 10 días antes del prick test, sin historia previa de inmunoterapia específica (ITE), ni omalizumab y que consintieran participar en el estudio. Todos ellos eran candidatos a recibir ITE frente a Parietaria judaica. Con objeto que seguían el patrón clínico habitual de pacientes monosensibles tratados con ITE y que, por tanto, resultaban un modelo válido para monitorizar la inmunomodulación que producía la ITE utilizando el nPar j 1 obtenido, se controlaron la severidad de su síntomas mediante escala analógica visual que redujo en 1 punto la mediana de síntomas, el consumo de fármacos y el área de la prueba cutánea, reduciéndose todos tras un año de ITE. No existieron modificaciones en las concentraciones polínicas significativas que influyesen en la sintomatolgoía de los pacientes. Se realizaron 3 extracciones de sangre. Una basal antes de iniciar ITE, la segunda a las 12 semanas del inicio (tras la primera dosis de mantenimiento) y la tercera al año del inicio. Se midió la capacidad de fijación de la IgE e IgG4 específicas de los pacientes del nPar j 1 en los tres tiempos indicados comparada con el extracto completo. En la mayor parte los pacientes se objetivó un reconocimiento mucho más específico con nPar j 1, permitiendo observar la inmunomodulación producida por la ITE (incremento de IgG4 y reducción de IgE específicas progresivos), que con el extracto completo. CONCLUSIONES 1. El procedimiento descrito en este trabajo permite obtener y estudiar el comportamiento proteico “in vitro” del nPar j 1, mediante el uso de tecnología recombinante y técnicas cromatográficas, a partir del extracto crudo de polen de Parietaria judaica. 2. El alérgeno nativo (nPar j 1) fue reconocido “in vitro” y de forma exclusiva (inmunoblotting IgE e IgG4 específicas frente a él) por 10 pacientes monosensibilizados y tratados durante un año con inmunoterapia específica frente a extracto completo de Parietaria judaica. 3. Se demostró la utilidad del alérgeno obtenido nPar j 1 como herramienta de monitorización individual de los cambios inmunológicos, en 10 pacientes monosensibles sometidos a inmunoterapia específica frente a extracto completo de Parietaria judaica, mediante el estudio de las variaciones de las capacidades fijadoras de IgE e IgG4.