De la metagenómica al cultivo purospiribacter salinus

Resumen

Las salinas constituyen excelentes modelos para el estudio de la biodiversidad y la ecología de los ambientes hipersalinos, ofreciendo un amplio rango de salinidades, desde la concentración del agua del mar hasta la saturación de sales. La salina ¿Bras del Port¿, en Santa Pola (Alicante), constituye una de las salinas mejor conocidas desde un punto de vista microbiológico. Numerosos estudios se han centrado en dicha salina, inicialmente basados en las técnicas clásicas de aislamiento de microorganismos y más recientemente en estudios independientes del cultivo y metagenómicos. Actualmente es más amplio el conocimiento que se tiene de los estanques cristalizadores, dominados por la arquea cuadrada Haloquadratum walsbyi y la bacteria halófila extrema Salinibacter ruber. No obstante, los estanques concentradores, de salinidades intermedias, están despertando el interés de muchos investigadores, siendo objeto de estudio en los últimos años. Por otro lado, los estudios realizados en ambientes naturales, en base a técnicas independientes de cultivo, han puesto de manifiesto que en general los microorganismos fácilmente aislados en cultivo puro en el laboratorio no constituyen la microbiota predominante en dichos ambientes (representando en muchos casos menos de un 1 % de la población microbiana allí presente) y por tanto, no constituyen modelos de estudio ideales para entender la ecología y el papel de los microorganismos en dichos ambientes. En un estudio realizado en 2011 por Ghai y colaboradores, describieron la población procariota presente en estanques con diferentes salinidades de la salina de Santa Pola, basándose en el análisis del ADN total procariota obtenido a partir de muestras de agua de un estanque al 19 % de salinidad (SS19) y de un estanque cristalizador con un 37 % de sales totales (SS37) de dicha salina. El análisis de la base de datos metagenómica SS19, reveló que especies frecuentemente aisladas de estos ambientes, miembros de los géneros Halomonas, Chromohalobacter o Salinivibrio, constituyen una mínima parte de la población microbiana allí presente, mientras que existen otros grupos de microorganismos muy abundantes en estos ambientes y que no han sido aislados hasta el momento. Concretamente se encontraron numerosas secuencias relacionadas con un organismo Euryarchaeota de bajo contenido en G+C, un Euryarchaeota de alto contenido en G+C y con una Gammaproteobacteria relacionada con los géneros Alkalilimnicola y Nitrococcus. Con el fin de intentar aislar estos nuevos grupos de microorganismos, identificados a través de los estudios metagenómicos, hemos realizado un muestreo a gran escala en estanques de diversas salinas, en diferentes períodos de tiempo, utilizando numerosos medios y condiciones de cultivo. Concretamente, en esta Tesis Doctoral nos hemos centrado en el estudio de salinas localizadas en diferentes áreas de la geografía española: la salina ¿Bras del Port¿ (Alicante), la salina de Isla Cristina (Huelva), las salinas Aragonesas y de Isla Bacuta (Marismas del Odiel, Huelva) y una salina localizada en Mallorca (Es Trenc). De esta forma, se obtuvieron más de 2000 colonias, las cuales se analizaron mediante la amplificación y secuenciación del gen ARNr 16S. Entre ellas se aisló una colonia de un diámetro inferior a 0,5 mm, correspondiente a un microorganismo de difícil y de lento crecimiento, relacionado filogenéticamente con los géneros Alkalilimnicola y Nitrococcus, el cual se caracterizó taxonómicamente y se describió como un nuevo género con una única especie, Spiribacter salinus M19-40 (León y col., 2014) dentro de la familia Ectothiorhodospiraceae. Más recientemente, hemos aislado en cultivo puro otras cepas bacterianas relacionadas con el género Spiribacter, una de las cuáles ha sido descrita como una nueva especie de dicho género, Spiribacter curvatus UAH-SP71 (León y col., 2015) y otras están siendo estudiadas en la actualidad. Posteriormente hemos realizado la secuenciación del genoma completo de todas las cepas aisladas, utilizando Illumina HiSeq 2000. S. salinus M19-40, la especie tipo del género Spiribacter, es una bacteria Gram-negativa que presenta una morfología muy peculiar. Al inicio de la fase exponencial las células presentan forma de bacilos curvados mientras que en la fase exponencial avanzada las células adoptan formas de largas espirales superenrrolladas, con numerosos gránulos de polihidroxialcanoatos. S. salinus M19-40 posee el genoma más pequeño que se ha descrito para miembros de la familia Ectothiorhodospiraceae (1,7 Mb), presenta un único operón ribosómico y un contenido en G+C de 62,7 %. Su genoma se caracteriza por ser streamlined, con una gran simplicidad metabólica, con la ausencia de las vías de fijación de carbono y quimiolitotrófica, un reducido número de secuencias de inserción y otros elementos genéticos móviles y la ausencia del sistema CRISPR y de flagelos. Todas estas características son frecuentemente encontradas en microorganismos oligotróficos con genomas reducidos (streamlined) que han demostrado alcanzar altas densidades de población en ambientes acuáticos y poseer un modo de vida muy eficiente, como es el caso de Pelagibacter en los océanos de todo el mundo. A pesar del reducido tamaño de su genoma las cepas bacterianas pertenecientes al género Spiribacter presentan los mecanismos de osmorregulación típicos de microorganismos que utilizan la estrategia salt-out. En este sentido, el análisis genómico y los ensayos en el laboratorio han puesto de manifiesto que S. salinus M19-40 posee la maquinaria necesaria para la síntesis de los solutos compatibles ectoína, glutamato y trehalosa. Adicionalmente posee numerosos transportadores, los cuales ha sido demostrado en estudios previos, responden al estrés osmótico, como es el caso del transportador de la familia de transportadores ABC OpuA, el trasnportador OpuD de la familia de transportadores betaina-colina-carnitina y el transportador TeaABC de la familia de transportadores TRAP. Existen otros solutos compatibles que pueden ser captados del medio externo y utilizados por S. salinus M19-40 como agentes osmoprotectores para hacer frente a las altas concentraciones salinas, como es el caso de la glicina betaína, el dimetilsulfoniopropionato y en menor medida, la colina-o-sulfato. Por otro lado, las distintas cepas presentan un gen que codifica una xantorrodopsina, el cual se encuentra formando un cluster con los genes implicados en la síntesis de retinal. Se trata de una xantorrodopsina perteneciente al subgrupo II, careciendo de los residuos aminoacídicos necesarios para la unión al ceto-carotenoide (pigmento antena). El gen que codifica la xantorrodopsina encontrado en la especie tipo S. salinus M19-40 presenta todos los grupos funcionales característicos para funcionar como una bomba de protones activada por la luz, lo que sugiere que se trata de una xantorrodopsina funcional. Con el objetivo de determinar si S. salinus M19-40 constituía la Gammaproteobacteria asociada a los géneros Nitrococcus y Alkalilimnicola, que por estudios metagenómicos había revelado ser una parte dominante de la comunidad microbiana presente a salinidades intermedias, se han llevado a cabo los reclutamientos de los genomas frente a diversas bases de datos metagenómicas de ambientes hipersalinos. Los resultados obtenidos muestran que el género Spiribacter es muy abundante en estanques con salinidades intermedias, disminuyendo bruscamente a bajas y a elevadas salinidades. Al mismo tiempo estos datos nos han permitido describir todas las cepas bacterianas miembros del género Spiribacter como especies bacterianas halófilas moderadas desde un punto de vista ecológico. Bibliografía Ghai, R., Pasic, L., Fernández, A. B., Martin-Cuadrado, A. B., Megumi Mizuno, C., McMahon, K. D., Papke, R. T., Stepanauskas, R., Rodriguez-Brito, B., Rohwer, F., Sánchez-Porro, C., Ventosa, A. y Rodríguez-Valera, F. (2011). New abundant microbial groups in aquatic hypersaline environments. Nature Sci. Rep. 1, 135. León, M. J., Fernández, A. B., Ghai, R., Sánchez-Porro, C., Rodríguez-Valera, F. y Ventosa, A. (2014). From metagenomics to pure culture: isolation and characterization of the moderately halophilic bacterium Spiribacter salinus gen. nov., sp. nov. Appl Environ Microbiol. 80, 3850-3857. León, M. J., Rodríguez-Olmos, A., Sánchez-Porro, C., López-Pérez, M., Rodríguez-Valera, F., Soliveri, J., Ventosa, A., Copa-Patiño, J. L. (2015). Spiribacter curvatus sp. nov., a new moderately halophilic bacterium from Santa Pola saltern in Spain. Int J Syst Evol Microbiol. doi: 10.1099/ijsem.0.000621. [Epub ahead of print].