Metagenómica comparativa de la biodiversidad procariota de una salina.

Resumen

Una salina consiste en una serie de estanques poco profundos unidos entre sí de manera que el agua del mar va gradualmente concentrándose hasta precipitar el cloruro sódico, principalmente y otras sales. La diversidad procariota varía a lo largo de este gradiente ambiental con poblaciones especializadas de microorganismos halófilos que desplazan a las poblaciones marinas en aquellos estanques de las salinas que poseen unas 4 ó 5 veces la media de la salinidad del agua de mar. En las regiones geográficas con una precipitación media anual baja, la salinidad de los estanques de las salinas solares se mantiene constante a lo largo de tiempo. La composición de la comunidad microbiana de las salinas es bastante estable a lo largo del tiempo (Rodriguez-Brito y col., 2010), incluso cuando se somete a perturbaciones ambientales (Gasol y col., 2004). Estudios a pequeña escala han descrito las salinas como un sistema con una baja riqueza de especies, una alta densidad de células procariotas y con cadenas tróficas cortas (Anton y col, 1999; 2000; Benlloch y col., 2001; 2002; Casamayor y col., 2002a; Pedrós-Alió, 2000). Esta simplicidad hace de las salinas un sistema modelo, presumiblemente, mucho más fácil de analizar que un ambiente marino más diverso (Rodríguez-Valera y col, 2009). El conjunto de estanques hipersalinos de las salinas ¿Bras del Port¿ en Santa Pola, Alicante, en particular, el estanque cristalizador CR30, ha sido objeto de múltiples estudios desde hace más de 30 años. Los estanques han sido estudiados usando varios enfoques, incluyendo técnicas de cultivo tradicional y técnicas moleculares de amplificación por PCR del gen de ARNr 16S y análisis de secuencias, hibridación fluorescente in situ y análisis de secuencias metagenómicas de librerías de fósmidos obtenidas por técnicas clásicas de secuenciación didesoxinucleótidos de Sanger (Anton y col, 1999; 2000; Benlloch y col., 2001; 2002; Casamayor y col., 2002, Legault y col., 2006; Rodriguez-Valera y col., 1985). La diversidad microbiana encontrada en el cristalizador fue baja con solo dos especies abundantes y ambas con estrategia ¿salt-in¿, la arquea cuadrada hiperhalófila Haloquadratum walsbyi (puede alcanzar hasta 80% de la población total) y la bacteria halófila extrema Salinibacter ruber (Antón y col., 1999, 2000; Benlloch y col., 2002; Legault y col., 2006). Sin embargo, la biomasa de este sistema es muy alta, alcanzando 108 células/ml. En contraste con los cristalizadores, existe muy poca información sobre los estanques con salinidades intermedias de las salinas, aunque representan un hábitat muy extendido en la naturaleza ya que el agua de mar es concentrada por evaporación, algo que ocurre en muchos ambientes geológicos tales como las lagunas costeras. Esta etapa intermedia se caracteriza por la deposición de yeso que forma una costra espesa en la parte inferior del estanque y es a menudo conocido por los geólogos como el dominio del yeso, en contraste con las salmueras saturadas que se referencian como el dominio de halita. Estudios llevados a cabo con cultivos puros muestran que estas aguas contienen una diversa variedad de microorganismos halófilos moderados pertenecientes a distintas subdivisiones bacterianas y al orden Halobacteriales (Rodríguez-Valera y col., 1985). Además, la productividad primaria se ha estimado que es relativamente baja, debido probablemente a la sustitución de los productores primarios menos halófilos por el alga halófila Dunaliella (Estrada y col., 2004). Finalmente estudios llevados a cabo por aproximaciones moleculares (Benlloch y col., 2002; Casamayor y col., 2002a), indican que el conjunto de procariotas está compuesto por diversos representantes de Gammaproteobacteria, Bacteroidetes y Halobacteriaceae, y con secuencias de ARNr 16S que a menudo no están relacionadas con microorganismos cultivados. Estudios moleculares independientes de cultivos han demostrado que en general, la diversidad basada en métodos clásicos de cultivos es menor al 1% de las especies bacterianas presentes en un ambiente (Amann y col., 1995). Sin embargo, las técnicas moleculares basadas en PCR y clonación introducen sesgos en el conocimiento de la riqueza de especies y en el funcionamiento de una comunidad microbiana (Casamayor y col., 2000, 2002a; Wintzingerode y col., 1997). Por ello, hemos utilizado la plataforma de secuenciación Genome Sequencer FLX Titanium Series de 454 Life Sciences para llevar a cabo la secuenciación del ADN total del ambiente a partir de tres estanques de las salinas Bras del Port a diferentes concentraciones salinas, 13%, 19% y 33% de NaCl. El propósito de esta Tesis Doctoral ha sido estudiar en detalle la estructura de la comunidad microbiana a nivel genómico en la columna de agua de varios estanques de las salinas ubicados en Santa Pola, Alicante (España), y de su estructura metabólica, así como los genes relacionados con solutos compatibles y de respuesta a estrés, el metabolismo del fosfato, carbono y azufre o genes fotosintéticos, con una profundidad mayor con la que se ha realizado previamente, usando para ello la secuenciación masiva mediante pirosecuenciación del ADN total de dichos estanques. Para este estudio se analizaron tres estanques concentradores con salinidades intermedias (13 %, 19 % y 33 %) de una salina solar situada en Santa Pola, Alicante (España). Además, se incluyeron datos metagenómicos de un estanque cristalizador saturado en NaCl (37 %) de esta misma salina y de dos bases de datos metagenómicas de bajas salinidades (3,8 % y 6,4 %) para examinar las tendencias producidas con el aumento de la salinidad y las adaptaciones hipersalinas. La abundancia relativa del contenido en G+C de las lecturas individuales en el conjunto de datos analizados reveló claras diferencias en la composición de las secuencias a lo largo del gradiente de salinidad, con un patrón unimodal para la muestra de origen marino con un pico alrededor de 34 % de G+C y con un patrón bimodal para muestras hipersalinas, con dos picos sobre el 48 % y el 65 % de G+C. El primer pico al 48 % del contenido en G+C se atribuyó a la haloarquea Haloquadratum walsbyi cuyo contenido genómico en G+C es del 47,9 %. Y el segundo pico aproximadamente al 65 % fue consistente con el contenido en G+C de los genomas de bacterias y arqueas hiperhalófilas, cuyo pico se encuentra en el rango entre el 60 % y el 70 % de G+C (Paul y col., 2008). El punto isoeléctrico (pI) de las proteínas microbianas es un indicativo de la estrategia de supervivencia empleada en condiciones hipersalinas. Hay dos estrategias principales que los microorganismos emplean para mantener las proteínas celulares estables en presencia de altas concentraciones de sal. Las proteínas de organismos con estrategia ¿salt-in¿ permanecen solubles en presencia de altas concentraciones de sal citoplasmáticas debido a la presencia de residuos de aminoácidos ácidos en la superficie de la proteína. En consecuencia, los valores de pI de las proteínas halófilas son más ácidos en comparación con las no halófilas (Paul y col, 2008; Soppa, 2006). Algunos organismos halófilos y halotolerantes hacen frente a la alta presión osmótica mediante la síntesis de solutos compatibles, estos son los organismos con estrategia ¿salt-out¿. La frecuencia de aminoácidos es también un indicador de la estrategia de supervivencia empleada para equilibrar su citoplasma osmóticamente con su medio, mostrando una preferencia por arginina en lugar de lisina en aquellos proteomas de microorganismos comúnmente halófilos. Por lo tanto, con el incremento de la salinidad hubo un mayor porcentaje de secuencias con un pI ácido y con un enriquecimiento en lisina sobre la arginina, pudiendo observarse como los microorganismos con estrategia ¿sal-out¿ fueron remplazados por los microorganismos con estrategia ¿salt-in¿. La diversidad microbiana a lo largo del gradiente de salinidad fue reducida, especialmente en el estanque cristalizador. En comparación con la diversidad encontrada en la muestra del Mediterráneo (3,8 % de NaCl), en la que se identificaron miembros de 11 phyla bacterianos y 2 phyla de arqueas, al 37% de salinidad, solo se observaron miembros de un phylum bacteriano y un phylum de arqueas. Además, debido a las condiciones extremas solo se observó la presencia de dos grupos procarióticos en todas las bases de datos metagenómicas: Bacteroidetes y Euryarchaeota. La estructura de la comunidad obtenida mediante la afiliación de las secuencias de ARNr 16S a nivel de género nos indicó el gran predominio de Haloquadratum walsby en el estanque cristalizador, extendiéndose su rango de crecimiento hasta el estanque de una concentración total del 13 % de NaCl. Después de Haloquadratum walsby, los géneros más abundantes a altas salinidades fueron Salinibacter y Halorubrum. Sin embargo, al 13 % de salinidad la proporción fue mayor para los géneros Roseovarius y Oceanicola. En el estanque concentrador al 19% de NaCl se han detectado nuevos grupos tanto de bacterias como de arqueas, como es el caso de un representante que está filogenéticamente relacionado con el phylum Gammaproteobacteria. Asimismo, se detectó la presencia de dos nuevos grupos de haloarqueas con alto y bajo contenido en G+C no relacionados con especies aisladas y descritas hasta la fecha. Este estudio ha puesto de manifiesto que existe un gran número de secuencias referidas a nuevos taxones sin cultivar, relacionadas con las poblaciones tanto de bacterias como de arqueas de las salinas ¿Bras del Port¿, aunque principalmente se encuentran afiliadas con la familia Halobacteriaceae a lo largo de todo el gradiente de salinidad. Por último, en el conjunto de ADN proveniente de procariotas halófilos se observó la presencia de pocos genes implicados en la fijación de carbono, función que probablemente se realiza por las algas (Dunaliella), siendo en gran medida estos procariotas heterótrofos. Sin embargo, la luz puede ser una fuente de energía fundamental para la asociación de procariotas a través de diferentes tipos de rodopsinas y la oxidación del monóxido de carbono. Las enzimas monóxido de carbono deshidrogenasas aumentaron con la salinidad, hecho que está en consonancia con la presencia mayoritaria de H. walsbyi (la secuencia del genoma contiene el operón cox completo que está relacionado con la fotólisis de CO2). Los genes implicados en la biosíntesis/transporte de solutos compatibles tales como la trehalosa o la betaína, pertenecían principalmente a bacterias y fueron más abundantes en el conjunto de datos de los estanques concentradores intermedios (al 13 % y al 19 % de NaCl). Bibliografía: Amann, R. I., Ludwig, W. & Schleifer, K. H. 1995. Phylogenetic identification and in situ detection of individual microbial cells without cultivation. Microbiol Rev 59: 143-169. Antón, J., Llobet-Brossa, E., Rodríguez-Valera, F. and Amann, R. (1999). 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