Formas moleculares de acetilcolinesterasa de fracciones microsomales de musculo esqueletico. Diferencias en su glicosilacion e interaccion con anticuerpos

Resum

LA ACETILCOLINESTERASA (EC 3.1.1.7, ACHE) HIDROLIZA LA ACETILCOLINA, PONIENDO FIN A LA TRANSMISION NERVIOSA COLINERGICA. ESTUDIAMOS ESTA ENZIMA EN EL SISTEMA SARCOTUBULAR (SS), CONJUNTO INTRACELULAR DE MEMBRANAS DE LA CELULA MUSCULAR, SE OBTENIAN PREPARACIONES DE MICROSOMAS ENRIQUECIDAS EN SS, QUE TENIAN UNA ACTIVIDAD ACHE DE 0'9 UMOL*H-1*MG-1 (U/MG) QUE AUMENTABA CON TRITON X-100 (TX100) A 2'3 U/MG. LA ACHE ESTA LIGADA A LAS MEMBRANAS DEL SS. CON EL DETERGENTE TX100 AL 0'5% SE SOLUBILIZABA UN 71% DE LA ACTIVIDAD ACHE, QUE CORRESPONDIA A TRES TIPOS DE MOLECULAS: MONOMERICAS G1 (57%) TETRAMERICAS G4 (19%) Y ASIMETRICAS A12 (24%). LA TRIPSINA ESTIMULO Y SOLUBILIZO LA ACHE DE SS POR DOS PROCESOS INDEPENDIENTES. LA PROTEASA ELIMINABA LA SUBUNIDAD ESTRUCTURAL "TALLO" DE LAS FORMAS A12 TRANSFORMANDOLAS EN G4; PERO ESTO NO IMPLICABA SU SOLUBILIZACION, LUEGO LAS A12 NO SE UNEN A LA MEMBRANA MEDIANTE DICHO TALLO. ENSAYOS DE CENTRIFUGACION EN GRADIENTES SIN DETERGENTES, CON TX100 O CON BRIJ 96, Y DE PARTICION DE FASES CON TX114 INDICARON QUE A12 Y G4 SON HIDROFILICAS, MIENTRAS QUE LA MAYORIA DE G1 ES ANFIFILICA PORQUE TIENE UNA REGION HIDROFOBICA DE ANCLAJE A LA MEMBRANA. LOS ANTICUERPOS AE1 Y AE2 PRECIPITARON LAS MOLECLAS A12 PERO NO LOS G1 ACTIVOS, DEMOSTRANDO QUE EXISTEN DIFERENCIAS EN LAS SUBUNIDADES CATALITICAS DE LOS DISTINTAS FORMAS. LOS ENSAYOS DE FIJACION DE ANTIGENO Y DE COMPETENCIA CON AE1 Y AE2 INDICARON QUE LOS EPITOPOS RECONOCIDOS POR ESTOS ANTICUERPOS NO SON CONFORMACIONALES, YA QUE SE CONSERVAN EN LA ENZIMA DESNATURALIZADA; E HICIERON PENSAR QUE EN SS EXISTEN FORMAS INACTIVAS DE ACHE, DE TAMAÑO SIMILAR AL DE G1, RECONOCIDAS POR AE1 Y AE2. POR CENTRIFUGACION DE LA PREPARACION MICROSOMAL DE SS COMPLETA EN GRADIENTES DE SACAROSA (20-45% P/P) SE SEPARARON TRES TIPOS DE VESICULAS: PESADAS (VP), MEDIAS (VM) Y LIGERS (VL). LA COMPOSICION PROTEICA EL BINDING DE RIANODINA Y DE OUBAINA, Y LAS ACTIVIDADES CA+2-ATPASA, MG+2/A