Análisis funcional de los dominios estructurales identificados en crga, un regulador negativo de la fotocarotenogénesis en mucor circinelloides

Resumo

Mucor circinelloides es un hongo filamentoso que presenta diversas respuestas a la luz azul, entre ellas, la inducción de la biosíntesis de carotenos. El gen crgA, un gen inducido por luz, parece actuar como regulador negativo de la carotenogénesis en este hongo, ya que la deleción completa del gen en la estirpe silvestre conduce a una sobreacumulación de carotenos en los micelios en condiciones de luz y oscuridad. El efecto represor de crgA sobre la biosíntesis de carotenos se lleva a cabo mediante el control de la expresión de los genes carotenogénicos estructurales, sin embargo, todavía no se conoce en profundidad como se lleva a cabo esta función reguladora. La secuencia de aminoácidos deducida del gen crgA muestra distintas regiones estructurales significativas: un dominio RING-finger, una posible señal de localización nuclear, tramos ricos en glutaminas y un posible dominio de isoprenilación. Con el objetivo de profundizar en el conocimiento del modo de acción de crgA, se ha analizado el papel que juega cada uno de estos dominios en su función reguladora de la carotenogénesis. Para ello, en primer lugar se ha obtenido, mediante mutagénesis química, un marcador adecuado en la estirpe nula para crgA, permitiendo la utilización de dicha estirpe en los experimentos de transformación. Posteriormente se han determinado con exactitud los extremos 5' y 3' de crgA para la construcción de plásmidos portadores de todas las regiones reguladoras necesarias para la correcta expresión del gen. Éstos plásmidos se han utilizado para la transformación del mutante nulo y se ha comprobado su capacidad para la complementación del fenotipo mutante para la carotenogénesis que presenta dicha estirpe, indicando que la proteína CrgA expresada es funcinal. A continuación, mediante mutagénesis dirigida, se han generado alelos mutantes de crgA alterados en sus regiones significativas y estos alelos se han utilizado para tr