Caracterización molecular del complejo SnRK1 de maíz

Resumen

SNF1/AMPK/SnRK1 es un complejo quinasa hetrotrimérico altamente conservado en todos los eucariotas estudiados, que regula respuestas celulares ante diferentes situaciones de estrés ambiental y nutricional. En levaduras y mamíferos, la subunidad quinasa (SNF1 y AMPK, respectivamente) interacciona con dos subunidades no catalíticas (beta y gamma) implicadas en la especificidad de sustrato, localización subcelular y regulación de la actividad catalítica. La identificación en plantas de la subunidad atípica AKIN-beta-gamma sugirió un nuevo modelo alternativo al clásico complejo heterotrimérico. Las subunidades AKIN-beta-gamma presentan en su extremo N-terminal un dominio KIS (Kinase Interacting Sequence) caracterísitico de las subunidades beta, fusionado a un dominio con similitud a las subunidades gamma. La existencia en plantas de otras subunidades del complejo SnRK1 atípicas, pone de manifiesto la diversidad y complejidad existente respecto a esta familia de proteínas. Esta tesis doctoral tiene como objetivo principal la caracterización del complejo SnRK1 de maíz a través de la caracterización de la subunidad ZmAKIN-beta-gamma y de la identificación de nuevas subunidades del complejo. En la primera parte de este trabajo se ha abordado la caracterización estructural del dominio conservado KIS de la proteína ZmAKIN-beta-gamma. La expresión en "E.coli" ha permitido la obtención de cantidades suficientes para realizar diversos ensayos de cristalización. Aunque no se ha conseguido la cristalización, la purificación de este dominio reveló la tendencia a la formación de dímeros más estables que la forma monomérica. Mediante experimentos de "pull down" se ha demostrado que la interacción entre el dominio KIS de ZmAKIN-beta-gamma es específica. La expresión de ZmAKIN-beta-gamma tanto a nivel de mRNA como de proteína se induce en condiciones de estrés osmótico en plántulas de maíz. Experimentos de inmunoprecipitación muestran la asociación de ZmAKIN-beta-gamma con subunidades catalíticas SnRK1, sin embargo el aumento de expresión ZmAKIN-beta-gamma no correlaciona con una aumento en la actividad SnRK1 inmunoprecipitada. Por otra parte, in vitro, ZmAKIN-beta-gamma es capaz de activar otra proteína de la subfamilia SnRK2. Se han identificado y clonado diferentes subunidades del complejo SnRK1 de maíz: 2 subunidades catalíticas (ZmSnRK1a y ZmSnRK1b), 1 subunidad del tipo beta (Zm-beta-1) y dos subunidades ? (Zm-gamma-1 y Zm-gamma-2). Ambas subunidades catalíticas complementan a los mutantes "snf1" y "snf4", indicando así su conservación funcional con la proteína SNF1. Estudios de actividad en "E.coli" indican además que el dominio catalítico de ZmSnRK1b presenta "per se" actividad quinasa "in Vitro". Se han realizado ensayos de doble híbrido para determinar las asociaciones entre las diferentes subunidades aisladas, sin embargo, ninguna de las subunidades catalíticas identificadas interacciona con las subunidades reguladoras. Con el objetivo de identificar nuevas subunidades que interaccionaran con la subunidad ZmSnRK1b se ha llevado a cabo un rastreo de doble híbrido utilizando una librería de embrión joven. Así, se han identificado diferentes proteínas que se han clasificado en grupos funcionales. Una de las proteínas identificadas, y con interacción específica para la subunidad ZmSnRK1b es la MnSOD. La interacción entre ambas proteínas tiene lugar a través del dominio regulador de la quinasa, según experimentos de doble híbrido en levadura. La sobreexpresión de ZmSnRK1b provoca la acidificación de la proteína MnSOD cuando ambas proteínas son cotransformadas en protoplastos de A. thaliana, sugiriendo un cambio en la modificación postraduccional de MnSOD, provocado por ZmSnRK1b. "SUMMARY: SNF1/AMPK/SnRK1 is a highly conserved kinase complex involved in the regulation of cellular responses to environmental and nutritional stress. In yeast and mammals, the kinase subunit (SNF1 and AMPK, respectively) interacts with two other non catalytic subunits (beta and gamma) involved in substrate specificity, subcellular localization and regulation of the kinase activity. In plants, the identification of the atypical AKIN-beta-gamma subunit of the SnRK1 complex similar to SNF4/AMPKg proteins suggest the possible existence of several SnRK1 complex (dimeric and trimeric) formed by different regulatory subunits as a mechanism of flexibility in plants. The major aim of this PhD work is the characterization of maize SnRK1 complex. For this purpose we have focused on two main objectives: the study of ZmAKIN-beta-gamma subunit and the identification of new SnRK1 components. Thus, protein expression in "E.coli" has demonstrated that the conserved KIS domain, present in ZmAKIN-beta-gamma associates into dimeric forms more stable than monomeric forms. "Pull down" experiments have shown the specificity of this interaction. Expression studies, at mRNA and protein level, have demonstrated ZmAKIN-beta-gamma induction under osmotic stress conditions in maize seedlings. Moreover, inmunoprecipitation experiments have showed that ZmAKIN-beta-gamma is associated with SnRK activity. For the second part, two catalytic subunits (ZmSnRK1a and ZmSnRk1b ), one scaffold subunit (Zm-beta-1) and two regulatory subunits (Zm-gamma-1 and Zm-gamma-2) have been isolated. Complementation analyses of yeast snf1 and snf4 mutants have demonstrated the conserved functionality of ZmSNRK1a and ZmSnRK1b with their yeast counterparts. By yeast two hybrid analyses we have studied interactions between the different subunits. However, none of the catalytic subunits interacted with the isolated regulatory subunits. To get more insight into ZmSnRK1b partners, a yeast- two hybrid screening was performed using a maize embryo library. Different proteins were isolated and we have focused on the study of the specific ZmSnRK1b interaction with a MnSOD, an important protein involved in the oxidative metabolism. "