Regulación de la fosfoenolpiruvato carboxilasa(pepc)y pepc.quinasa durante el desarrollo de semillas de cebada. Clonación y caracterización de pepcs de cereales(sorgo y trigo)expresadas en e. coli como proteinas de fusión A His.

Resumen

La fosfoenolpiruvato carboxilasa (PEPC; EC 4.1.1.31) es una enzima citosólica ampliamente distribuida tanto en organismos fotosintéticos tales como plantas y algas verdes, como en la mayoría de las bacterias y protozoos no fotosintéticos, sin embargo está ausente en hongos, levaduras y animales (Chollet et al., 1996). Catalizar la beta-carboxilación irreversible del fofoenolpiruvato (PEP) en presencia de HCO3- y Mg2+, para producir oxaloacetato (OAA) y Pi (Chollet et al., 1996), que es rápidamente transformado a L-Malato, participando éste en una gran variedad de contextos metabólicos. Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio pusieron de manifiesto un aumento de la actividad PEPC durante la germinación de la semilla y la regulación de la enzima por fosforilación reversible (Osuna et al., 1996; González et al., 1998, 2002). A diferencia de las PEPC-quinasas estudiadas hasta la fecha, la activación de la PEPC-quinasa implicada en la germinación no dependía de síntesis proteica, sino que se encontraba ya presente en la semilla seca (Osuna et al., 1999), sugiriéndose que la síntesis de la PEPC-quinasa se realizaba durante la fase de desarrollo y maduración de la semilla. Los resultados de esta tesis muestran que en cebada durante el desarrollo de la semilla existen dos polipéptidos de PEPC de 103 y 108 kDa de los cuales, la subunidad de 103 kDa es constitutiva mientras que la de 108 kD se induce en la etapa final del desarrollo. Los resultados muestran que ambos polipéptidos son versiones completas y no contienen los extremos N- y C-terminal incluyendo los últimos 4 aa ANTG del C-terminal. Por otro lado se muestra que la PEPC-quinasa se acumula en la semilla de cebada a partir de los 30 PDA y queda acumulada en la semilla seca, sin embargo, durante este período y en la semilla seca, la PEPC está desfosforilada. Además los resultados obtenidos permiten concluir que es la relación Glucosa-6P/L-Malato, m