Patrón de expresión de tres genes como marcador de predicción pronóstica en neuroblastoma. Mecanismos de regulación transcripcional y función de los genes seleccionados”

Resumen

El neuroblastoma (NB) agrupa un espectro muy heteroge¿neo de tumores que evolucionan de forma radicalmente distinta. La variedad de comportamiento cli¿nico del NB determina el enfoque terape¿utico, que puede variar entre un abordaje terape¿utico intensivo multimodal o una actitud expectante. Por lo tanto, la clasificacio¿n precisa de los diferentes subtipos de NB es importante para determinar el tratamiento ma¿s apropiado. Actualmente los sistemas de clasificacio¿n de riesgo cli¿nico en NB se basan en distintos para¿metros cli¿nicos, biolo¿gicos y morfolo¿gicos. No obstante, todavi¿a existen casos donde estos sistemas de clasificacio¿n muestran una utilidad cli¿nica limitada. Existen perfiles de expresio¿n ge¿nica que definen el comportamiento biolo¿gico de cada subgrupo de NB y que permiten predecir el prono¿stico de los pacientes. Sin embargo, las listas de genes son demasiado extensas para poder implementarlas en la rutina cli¿nica. En esta tesis, hemos desarrollado un modelo estadi¿stico de prediccio¿n de prono¿stico basado en la combinacio¿n lineal de los niveles de expresio¿n de tres genes, CHD5, NME1 y PAFAH1B1, diferencialmente expresados en subgrupos de NB con comportamiento cli¿nico distinto y asociados de forma estadi¿sticamente significativa con la evolucio¿n cli¿nica del paciente. Su potencial predictivo ha sido validado utilizando datos de expresio¿n obtenidos experimentalmente mediante qRT-PCR y de dos bases de datos pu¿blicas de microarrays de expresio¿n. En todas las cohortes analizadas el modelo muestra una excelente capacidad para clasificar a los pacientes con una evolucio¿n cli¿nica distinta. Los distintos ana¿lisis multivariantes ha identificado el modelo como un marcador de prediccio¿n de prono¿stico independiente a los marcadores actualmente aceptados para NB. En conclusio¿n, se ha desarrollado un modelo estadi¿stico de prediccio¿n de prono¿stico basado en una te¿cnica convencional (qRT-PCR), que podri¿a ayudar a refinar los actuales sistemas de estratificacio¿n de riesgo cli¿nico en NB. Uno de los genes incluidos en este modelo, CHD5, es un potencial gen supresor de tumores localizado en la regio¿n cromoso¿mica 1p36.31, recurrentemente perdida en NB. Estudios previos han identificado que CHD5 se expresa en tejidos neurales normales y en NB de bajo riesgo cli¿nico. Nosotros hemos descrito por primera vez el perfil inmunofenoti¿pico de CHD5. En tejidos neurales normales se identifico expresio¿n nuclear en ce¿lulas de estirpe neuronal mientras que las ce¿lulas gliales mostraron ausencia de tincio¿n. La caracterizacio¿n en los tumores neurobla¿sticos (TN) ha identificado la expresio¿n proteica circunscrita al nu¿cleo de las ce¿lulas neurobla¿sticas en diferenciacio¿n y de las ce¿lulas ganglionares, y ausente en los neuroblastos indiferenciados y las ce¿lulas de tipo Schawnn. En los TN, la tincio¿n nuclear muestra una correlacio¿n estadi¿sticamente significativa con una evolucio¿n cli¿nica ma¿s favorable de los pacientes. Sugiriendo que la tincio¿n inmunohistoqui¿mica de CHD5 podri¿a representar un marcador u¿til para refinar los actuales sistemas de determinacio¿n del prono¿stico en NB. El ana¿lisis de la expresio¿n de este gen en muestras apareadas de NB obtenidas al diagno¿stico y post-tratamiento, tambie¿n sugiere podri¿a representar un marcador inmunohistoqui¿mico cli¿nicamente u¿til para una identificacio¿n ra¿pida de pacientes que no se benefician del tratamiento convencional ya que actualmente en NB no existe ningu¿n biomarcador de respuesta a tratamiento. Las modificaciones epigene¿ticas representan uno de los principales mecanismos de modulacio¿n de la expresio¿n ge¿nica. Alteraciones en estos mecanismos, como la alteracio¿n del patro¿n de metilacio¿n del ADN, podri¿an estar implicadas en las variaciones de expresio¿n ge¿nica identificadas entre subgrupos de NB. En NB se han identificado numerosos genes que sufren hipermetilacio¿n asi¿ como la asociacio¿n entre subgrupos cli¿nicos de riesgo y genes hipermetilados. Sin embargo el patro¿n global de metilacio¿n del NB es au¿n considerablemente desconocido. Mediante microarrays hemos realizado un ana¿lisis global del estado de metilacio¿n del genoma del NB que nos ha permitido identificar patrones de metilacio¿n especi¿ficos del NB, asi¿ como patrones distintivos entre subgrupos cli¿nicos y biolo¿gicos de NB. Nuestras observaciones muestran como el ADN del NB se ve afectado por una elevada disminucio¿n de los niveles de metilacio¿n. Dicha hipometilacio¿n es gen-especi¿fica y afecta a funciones biolo¿gicas relacionadas con ca¿ncer asi¿ como a genes relevantes para la patoge¿nesis del NB como CCND1. Cabe destacar, que la metilacio¿n diferencial de CCND1 afecta principalmente a una regio¿n evolutivamente conservada y funcionalmente relevante localizada en 3¿UTR, sugiriendo que la hipometilacio¿n fuera de las regiones promotoras puede tener un papel en el desarrollo del NB. La hipermetilacio¿n afecta genes involucrados en el desarrollo celular y en la proliferacio¿n, como RASSF1A, POU2F2 o HOXD3 entre otros. Los resultados obtenidos proporcionan nuevos candidatos a biomarcadores epigene¿ticos asociados al NB, asi¿ como nuevos conocimientos sobre las bases moleculares de estos tumores.