Caracterización de modelos murinos deficientes en Cdk2, Cdk4 y Cdk6

Resumen

1. Índice 1 2. Resumen 7 3. Introducción 11 3.1. El ciclo celular 13 3.2. Control molecular del ciclo celular en mamíferos 14 3.2.1. Quinasas dependientes de ciclina (Cdks) 15 3.2.2. Ciclinas 18 3.3. Regulación de la actividad de las Cdks 18 3.3.1. Asociación con ciclinas 20 3.3.2. Interacciones con moléculas inhibitorias 21 3.3.3. Fosforilaciones activadoras 23 3.3.4. Fosforilaciones inhibitorias 24 3.4 Eventos moleculares durante el ciclo celular 24 3.4.1. Regulación de la re-entrada en ciclo y progresión a través de fase G1 25 3.4.2 Transición G1/S 26 3.4.3 La fase S del ciclo, la transición G2/M y la mitosis 28 3.5 Programa transcripcional del ciclo celular 30 3.6 Análisis genético del ciclo celular 32 3.6.1. Modelos KO de Cdk4 33 3.6.2. Modelos KO de Cdk6 34 3.6.3. Modelos KO de Cdk4 y Cdk6 34 3.6.4. Modelos KO de Cdk2 35 3.6.5. Modelos KO de Cdk2 y Cdk6 36 3.7 Alteraciones en la fase G1 y en la transición G1/S en cáncer 36 4. Objetivos 41 5. Materiales y Métodos 45 5.1 Experimentos in vivo 47 5.1.1. Mantenimiento y genotipaje de los ratones 47 5.1.2. Tratamiento con 4-Hidroxitamoxifeno (4-OHT) 48 5.1.3. Infecciones con adenovirus 49 5.1.4. Medición de los niveles de glucosa en sangre 49 5.1.5. Histopatologíae inmunohistoquímica 49 5.1.6. Análisis de los precursores hematopoyéticos 49 5.1.7. Análisis de las poblaciones hematopoyéticas maduras 50 5.1.8. Ensayos de regeneración hepática 51 5.1.9. Ensayos de cicatrización de heridas 52 Javier Galán Antoñanzas Índice 4 5.2. Experimentos in vitro 52 5.2.1. Preparación de fibroblastos embrionarios murinos y condiciones de cultivo 52 5.2.2. Entrada en fase S 53 5.2.3. Análisis de perfiles de expresión génica 53 5.2.4. PCRs convencionales 53 5.2.5. Extracción de ADN y proteínas 54 5.2.6. Análisis de ADN genómico por southern blot 54 5.2.7. Análisis de proteínas 55 6. Resultados 57 6.1. Determinación de los perfiles transcripcionales de fibroblastos embrionarios murinos 59 6.2. Generación de animales defectivos en Cdk4 y Cdk2 67 6.2.1. Generación de animales deficientes en Cdk4 y Cdk2 67 6.2.2. Caracterización fenotípica de los animales doble mutantes para Cdk4 y Cdk2 70 6.2.3. Estudio histológico de los animales doble KO para Cdk4 y Cdk2 74 6.2.4. Estudio de la proliferación y muerte celular en animales doble KO para Cdk4 y Cdk2 77 6.2.5.Caracterización bioquímica de los reguladores de ciclo celular en animales doble KO de Cdk4 y Cdk2 80 6.2.6 Estudio de la hematopoyesis adulta en los animales doble KO Cdk4 y Cdk2. 81 6.2.7. Regeneración hepática en ausencia de Cdk4 y Cdk2 84 6.2.8 Ensayos de cicatrización de heridas en ausencia de Cdk4 y Cdk2 89 6.3 Generación de animales deficientes en Cdk4, Cdk6 y Cdk2 91 6.3.1 Caracterización de animales deficientes en Cdk4, Cdk6 y Cdk2. Hepatectomías parciales 92 7. Discusión 95 7.1. Hacia un nuevo modelo del ciclo celular 97 7.2. Animales doble KO para Cdk2 y Cdk6 99 7.3. Animales doble KO para Cdk4 y Cdk6 99 7.4. Animales doble KO para Cdk2 y Cdk4 101 7.4.1. Cdk2 y Cdk4 resultan dispensables durante la vida adulta del ratón 102 Javier Galán Antoñanzas Índice 5 7.4.2. Cdk4 y Cdk2 resultan dispensables para la proliferación celular en animales adultos 104 7.4.3. Los niveles de reguladores de ciclo celular permanecen inalterados en ausencia de Cdk4 y Cdk2 105 7.4.4 Estudio de la hematopoyesis adulta en los animales doble KO para Cdk4 y Cdk2 105 7.4.5. Los hepatocitos adultos son capaces de entrar en división y proliferar normalmente en ausencia de Cdk4 y Cdk2 106 7.4.6. Los queratinocitos deficientes en Cdk4 y Cdk2también son capaces de proliferar bajo condiciones de estrés celular 107 7.4.7. Animales doble KO clásicos para Cdk4 y Cdk2 108 7.5. Animales triples KO para Cdk2, Cdk4 y Cdk6 y animales KO sencillos para Cdk1. De vuelta al ciclo celular de levaduras. 109 7.6. Las Cdks como dianas terapéuticas en los procesos neoplásicos 113