The CRYO-EM structure of RNA polymerase i stalled at UV light-induced damage unravels a new molecular mechanism to identify lesions on ribosomal dna

Resumen

En las células eucariotas, tres ARN polimerasas (Pols) transcriben el genoma, y cada una es especialista en transcribir un conjunto específico de genes. Pol II sintetiza ARNm, Pol III produce ARNs cortos no transcritos y Pol I transcribe el ADN ribosomal (ADNr). Éste último produce el ARNr precursor, el cual después de su procesamiento constituye el esqueleto del ribosoma. Pol I representa aproximadamente el 60% de la actividad transcripcional en células en crecimiento y además lleva a cabo la supervisión de la integridad del rADN. Por lo tanto, es una clave determinante para el control del normal funcionamiento de la célula. Las amenazas medioambientales pueden generar lesiones en el ADN que son citotóxicas para las células, y una de las más conocidas es la luz ultravioleta (UV). El principal daño en el ADN producido por este agente externo es el cis-syn dímero de pirimidina ciclobutano (DPC), una lesión voluminosa en el ADN, la cual puede introducir distorsiones en la hélice de ADN y, por lo tanto, puede obstruir procesos fundamentales como la transcripción. El principal objetivo de este trabajo es entender las bases estructurales de Pol I bloqueada por un daño en el ADN inducido por la luz UV. La principal contribución de este proyecto es la obtención de un modelo atómico de Pol I en complejo de elongación con una lesión DPC en la hebra molde de ADN, derivado de la estructura resuelta por crio microscopía electrónica y procesamiento digital de imágenes a 3.6 Å de resolución. Esta estructura muestra que la lesión de DPC induce un intermedio de translocación temprano que, sumado a varias reorganizaciones conformacionales de elementos estructurales de Pol I dentro de la hendidura donde se produce la unión del ADN, contribuyen a detener a la enzima. La estructura revela que el residuo de arginina 1015 de la hélice puente es importante para el bloqueo de la enzima, lo que fue confirmado por análisis mutacionales usando la ARN polimerasa de E.coli como sistema modelo. Los ensayos de transcripción in vitro comparando el comportamiento de Pol I y Pol II en presencia de DPC revelan que mientras Pol II puede saltar lentamente la lesión, Pol I se bloquea delante de la lesión debido al balance entre una incorporación de nucleótidos lenta y una actividad intrínseca de corte del ARN rápida. En conjunto, nuestros resultados revelan el mecanismo molecular de Pol I bloqueado por una lesión DPC, el cual es diferente de Pol II detenido. Este proyecto de investigación abre una vía para descifrar los mecanismos moleculares que subyacen en la resistencia celular a las lesiones en el ADNr.