Evaluación de la expresión diferencial de hotspots de roturas de doble hebra de ADN y su regulación por la respuesta daño genómico en la meiosis de Saccharomyces cerevisiae

Resumen

La meiosis es un proceso celular común a los organismos con reproducción sexual. Durante la profase de la primera división meiótica se ocasiona daño genómico en forma de roturas de doble cadena de ADN para asegurar el apareamiento de los cromosomas homólogos y la correcta segregación de estos. Estas roturas ocurren en lugares concretos del ADN conocidos como puntos calientes o hotspots. Sin embargo, a día de hoy muchos de los procesos que regulan la producción de este daño no están completamente descritos. En la presente tesis se ha pretendido comprobar un modelo de predicción que cataloga a los hotspots del organismo Saccharomyces cerevisiae en dos poblaciones. Una de las poblaciones estaría más regulada por la fosforilación de la proteína Rec114, perteneciente al complejo Spo11, encargado de efectuar el daño en el ADN, y la otra respondería menos a esta regulación. De esta manera en los hotspots menos regulados se acumularían roturas más rápido que en los más regulados. Para probar la validez del modelo, en este estudio, se tomaron parejas hotspots, uno perteneciente a cada población, y se compararon entre ellos en cuanto a la diferencia temporal existente a la hora de alcanzar el cincuenta por ciento del máximo de roturas. Los resultados mostraron que todos los hotspots de la población menos regulada se expresaron más rápido que los de la más regulada. También se comprobó que existían diferencias estadísticas en lo referente a la temporalidad de producción de roturas en la mitad de las parejas de hotspots estudiadas. Por lo tanto, los resultados sugieren que el modelo podría ser válido. Sin embargo, se necesitan más estudios para ratificarlo. Por otro lado, en esta tesis se ha pretendido comprobar los efectos que la mutación de RAD53 tuviese para la producción de roturas de doble cadena. Sin embargo, los resultados mostraron que la ausencia de la actividad de este gen durante el ciclo de crecimiento vegetativo causa un aumento de células detenidas en la fase G2 del ciclo. Esto imposibilitó comprobar el efecto de la mutación de Rad53 sobre las roturas de doble cadena. Los resultados mostraron también que la mutación de RAD9, gen que codifica una proteína encargada de activar a Rad53 en respuesta a daño en el ADN, no causa esta clase de alteraciones en el ciclo. Es por tanto que delecionar RAD9 podrá ser utilizado como aproximación en futuros análisis para comprobar el efecto de Rad53 sobre los hotspots de roturas de doble cadena meióticas. Por último, se ha pretendido dilucidar la causa por la que la sustitución por alanina de la treonina 181 de Hop1, proteína perteneciente a los elementos axiales del complejo sinaptonémico, causa un descenso en la viabilidad de esporas y en la cantidad de roturas de doble cadena meióticas. Se ha comprobado, mediante la producción exógena de roturas de doble cadena, que la presencia de la treonina 181 de Hop1 es necesaria para que, a su vez, Hop1 sea fosforilada en respuesta a ese daño. También se ha observado que la sustitución de la treonina 181 por aminoácidos fosfomiméticos, esto es, que actúan como si estuviesen constitutivamente fosforilados, es capaz de restaurar parcialmente la viabilidad de esporas. En cuanto a este parámetro, se ha examinado que una mayor dosis génica es capaz de resturar la viabilidad de determinados mutantes de HOP1 codificantes para sustituciones de la treonina 181. Por último, cepas heterocigotas con un alelo de HOP1 codificante para una sustitución en la treonina 181 y un alelo de HOP1 codificante para una sustitución en la treonina 318, mostraron una reducción en la viabilidad de esporas. Todos estos resultados sugieren que es improbable que la treonina 181 de Hop1 sea fosforilada y que, a su vez, es necesaria para la estabilidad estructural de la proteína o bien para la correcta interacción de esta con otros componentes del complejo sinaptonémico. Futuros estudios deberán aproximarse a la estabilidad de Hop1 cuando la treonina 181 ha sido sustituida.