El eje NOX2-NOX4-metabolismo, una nueva herramienta terapéutica frente a la Leucemia Mieloide Crónica

  1. Marta Romo González
Supervised by:
  1. Ángel Hernández Hernández Director

Defence university: Universidad de Salamanca

Year of defence: 2022

Committee:
  1. María Monsalve Pérez Chair
  2. Rubén Quintana Cabrera Secretary
  3. Ana del Río Machín Committee member
Department:
  1. BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR

Type: Thesis

Teseo: 749094 DIALNET

Abstract

La LMC es un trastorno mieloproliferativo clonal producido por la translocación t(9;22)(q34;q11), conocida como el cromosoma Filadelfia. Esta translocación conduce a la yuxtaposición de los genes c-ABL1 (del inglés Abelson Leukemia Virus) y BCR (del inglés Breakpoint Cluster Region), generando así el gen quimérico BCR-ABL1 que codifica una oncoproteína con actividad tirosina quinasa que recibe el mismo nombre. La adquisición de este gen de fusión ocurre en una sola célula madre hematopoyética multipotente llamada célula madre de leucemia (LSC, del inglés Leukemic Stem Cells), que aún no está comprometida con la diferenciación mieloide o linfoide. De este modo BCR-ABL1 le aporta a esta célula una ventaja proliferativa y una capacidad de diferenciación aberrante responsables de la expansión de progenitores mieloides en la médula ósea. Si bien la sola presencia de BCR-ABL es suficiente para desencadenar la LMC, a medida que la enfermedad progresa aparecen nuevas alteraciones que modifican el comportamiento de las células leucémicas, reducen la sensibilidad a los tratamientos y favorecen aún más el avance a estados más similares a una leucemia mieloide aguda. Con la salida al mercado a principios de los años 2000 de los inhibidores tirosina quinasa (TKI) específicos contra BCR-ABL, el pronóstico de la LMC sufrió una revolución, pasando de ser una enfermedad de resultado fatal a una de pronóstico favorable. Aunque en gran parte de los pacientes el tratamiento continuado con TKI logra controlar la progresión de la enfermedad, la resistencia primaria o secundaria a estos tratamientos sigue suponiendo una grave amenaza, lo que justifica la búsqueda de nuevas opciones terapéuticas. BCR-ABL presenta actividad tirosina quinasa constitutiva, activando una plétora de vías de señalización como PI3K/AKT, MAPKs o STAT5 que son responsables del fenotipo proliferador, antiapoptótico y del bloqueo de la diferenciación característico de las células tumorales. Pero, además, BCR-ABL induce cambios en dos importantes características distintivas de las células leucémicas: produce un incremento de ROS (del inglés Reactive Oxygen Species) celulares y modifica las necesidades y dependencias metabólicas. Las ROS colaboran en el control de varías de las rutas de señalización controladas por BCR-ABL, y favorecen la aparición de mutaciones puntuales y ruptura de doble cadena por su gran poder oxidante. Una de la fuentes más fuertemente implicadas en la elevación de los niveles de ROS en LMC es la familia de enzimas NADPH oxidasas, cuya única función conocida hasta el momento es precisamente la de producir ROS. Esta familia de enzimas transmembrana se comprende de 7 miembros: NOX1-4, que son dependientes de la subunidad estabilizadora p22phox; y NOX5, DUOX1 y DUOX2 cuya actividad está regulada por calcio. La expresión de BCR-ABL induce la glucólisis aerobia, fenómeno conocido como efecto Warburg, al incrementar la entrada y metabolismo de la glucosa en detrimento de la fosforilación oxidativa (OXPHOS) mitocondria, y su gran capacidad para generar energía. Pero este viraje metabólico hacia la glucólisis parece no tener lugar en las LSC donde la glucosa captada se destina al OXPHOS mitocondrial, entre otros factores por su menor dependencia de BCR-ABL para sobrevivir. Tanto la sobreproducción de ROS como los cambios metabólicos descritos se han relacionado con la resistencia y progresión de la LMC a etapas más agresivas de la enfermedad. Las ROS son capaces de modular el metabolismo celular al afectar directa o indirectamente a reguladores maestros del metabolismo como la AMPK o HIF1; así como gracias a su capacidad para oxidar directamente a enzimas metabólicas como la GAPDH, la PKM2 o la PDH. Así en esta tesis nos planteamos investigar el papel que podrían estar cumpliendo las ROS producidas vía NADPH oxidasas sobre la particular adaptación metabólica de las células de LMC. Así, decidimos silenciar el homólogo NOX2, el más fuertemente relacionado con las células hematopoyéticas, así como la subunidad estabilizadora p22phox, esencial para el funcionamiento de NOX1-NOX4 y encontramos que las células NOX2 silenciadas, pero no las p22phox silenciadas indujeron el flujo de glucosa a través de la glucólisis y la entrada de piruvato a la mitocondria en células K562 mediante el estudio del destino metabólico de la glucosa con 13C6-glucosa. Además, encontramos que el silenciamiento de NOX2 aumenta el OXPHOS mitocondrial y la producción de ROS mitocondriales. Este efecto estuvo acompañado de una reducción en la ruta de señalización PI3K/AKT/mTOR y una activación de GSK3β que puede ser responsable de algunas de las adaptaciones metabólicas descritas. El hecho de encontrar que el silenciamiento de NOX2, pero no el de p22phox inducía cambios metabólicos, nos llevó a plantear que, además de NOX2, otro miembro de la familia dependiente de p22phox estuviese implicado en la regulación del metabolismo de la LMC. Encontramos que silenciamiento de NOX2 incrementó los niveles de ARN mensajero de NOX4 y la expresión proteica de p22phox en células enteras y en extractos enriquecidos en mitocondrias. NOX4 es el homólogo de la familia más fuertemente relacionado con la mitocondria, existiendo diversos artículos que localizan a esta proteína en la mitocondria o en las uniones retículo endoplásmico (RE)-mitocondria, donde se le ha asignado una función en la regulación metabólica mitocondrial. Siguiendo esta idea, el análisis metabólico y transcriptómico avaló la existencia de un eje NOX2-NOX4-mitocondria, observando que el silenciamiento de NOX4 evita el incremento en el OXPHOS provocado por el silenciamiento de NOX2 y el enriquecimiento de vías relacionadas con el metabolismo. Por último, evaluamos el potencial terapéutico de la inhibición de las NADPH oxidasas junto con el inhibidor de la hexoquinasa, 2DG; el inhibidor de la lactato deshidrogenasa, oxamato; o con el inhibidor de la piruvato deshidrogenasa quinasa, el DCA. Encontramos que la inhibición química de las NOX presentó un fuerte efecto sinérgico con los inhibidores del metabolismo 2DG, DCA y oxamato en líneas celulares y muestras de pacientes de LMC, además de ser igualmente eficaz en el tratamiento de células resistentes a los TKI. Por último, la inhibición específica de NOX2 con GSK2795039 junto con el DCA redujo de manera sinérgica la proliferación y capacidad clonogénica tanto en líneas celulares como en muestras de pacientes de LMC. Todos estos datos en conjunto muestran la existencia de un eje funcional NOX2-NOX4-metabolismo en LMC con un importante potencial terapéutico para el tratamiento de esta leucemia.