Regulación de las cadenas nacientes bajo estrés replicativo por el checkpoint de fase S

Resumen

La replicación del DNA, un proceso necesario para la proliferación celular, puede perturbarse tanto por factores endógenos como exógenos. Estas perturbaciones pueden acabar en mutaciones o lesiones en el DNA, tales como roturas o aberraciones cromosómicas, resultando en inestabilidad genómica y reduciendo seriamente la viabilidad celular. Por ello, existen mecanismos celulares como el checkpoint de fase S, para responder adecuadamente a estas perturbaciones que aparecen durante la replicación y evitar situaciones dañinas. El checkpoint de fase S consiste en un sistema de transducción de señales en el que las principales enzimas son dos quinasas: una quinasa sensora Mec1 (ATR en humanos, Rad3 en S. pombe) y una quinasa efectora Rad53 (CHK2 y Cds1 en humanos y S. pombe respectivamente). Una de las funciones esenciales del checkpoint de fase S frente a condiciones de estrés replicativo es la estabilización de las horquillas de replicación. En ausencia de un checkpoint funcional las horquillas de replicación colapsan de forma irreversible, lo cual es un proceso dependiente de Exo1, una nucleasa de la familia Rad2 con actividad 5’-3’ exonucleasa y flap-endonucleasa. Además, en mutantes del checkpoint de fse S se han observado estructuras hemireplicadas que podrían formarse por un defecto en la regulación de la síntesis de las cadenas leading y/o lagging. Nuestro objetivo ha sido investigar los distintos mecanismos por los que el checkpoint de fase S estabiliza las horquillas de replicación bloqueadas. Por un lado, hemos estudiado el mecanismo molecular de regulación de Exo1, y hemos demostrado que la fosforilación dependiente de Rad53 inhibe de manera específica la actividad 5’-3’ exonucleasa, revelando que esta actividad es la responsable del colapso de horquillas. Por otro lado, hemos analizado la enzimología de la replicación de las cadenas leading y lagging en condiciones de estrés replicativo. Para ello, usamos la técnica de secuenciación masiva Polymerase-Usage sequencing (PU-seq), la cual permite distinguir la replicación de ambas cadenas. Nuestros resultados indican que la ausencia de un checkpoint funcional resulta en un defecto especifico en la cadena leading en condiciones de estrés replicativo. Este defecto es dependiente de la actividad exonucleasa de Exo1, demostrando una relación entre la degradación de la cadena leading y el colapso de horquillas de replicación.