Simplificando la biología para optimizar la reparación

Resumen

Todos los seres vivos, desde los organismos unicelulares hasta los complejos animales pluricelulares y multisistémicos, incluidos los vertebrados, poseen una variedad de barreras físicas y químicas, así como un repertorio de respuestas fisiológicas para asegurar la integridad, la supervivencia y la homeostasis, procesos que a menudo se agrupan como sistema inmunitario o de defensa del huésped. Un tema persistente en la evolución de los animales ha sido la prevención tanto de la pérdida de líquidos como de la invasión de patógenos a consecuencia de la alteración de las barreras anatómicas, físicas y químicas inducida por un traumatismo o una infección. Para hacer frente a estas dos emergencias vitales, se ha desarrollado un vasto repertorio de respuestas inmediatas y locales con funciones en la infamación y la coagulación, que consisten en el sellado de heridas y la eliminación de patógenos, lo que resulta en la restauración de la homeostasis y la curación de heridas. La función inmunoreparadora de la inmunotrombosis se basa en biomoléculas que incluyen la trombina, el fibrinógeno, los factores de crecimiento, las citocinas y las micropartículas que se originan principalmente en el plasma, las plaquetas activadas y los macrófagos residentes en el tejido, todos los cuales son inductores y facilitadores de la reparación tisular. Varias proteínas multidominio intravasculares de los sistemas de coagulación y fibrinolítico, incluyendo la trombina, la fibrina(fibrinógeno), la plasmina(plasminógeno), el FXII y otras serinas proteasas filogenéticamente y estructuralmente están relacionadas, y con funciones importantes en la reparación de heridas. Además, el contenido de los gránulos de las plaquetas que incluyen factores de crecimiento y citoquinas son necesarios para la reconstrucción del tejido después de la lesión. De hecho, las proteínas del sistema de coagulación son proteínas con acción pleiotrópica con funciones que abarcan la coagulación, inflamación y la reparación de lesiones. Así, el desarrollo de los concentrados plaquetarios se puede entender como una herramienta para beneficiarse de estos mecanismos de reparación. La historia reciente del plasma rico en factores de crecimiento comenzó a principios del siglo XX con el uso de la fibrina y sus derivados como agentes hemostáticos en cirugía. Más recientemente, Tayapongsak et al. utilizaron clínicamente la fibrina autóloga como adyuvante en la cirugía maxilofacial. Estos primeros conceptos de combinar las propiedades de dos productos, los selladores de fibrina y los factores de crecimiento plaquetario, condujeron al desarrollo de las tecnologías de la matriz autóloga de fibrina. Siguiendo estos principios, Marx desarrolló en 1998 un método para producir plasma rico en plaquetas (PRP) a partir de un separador de gradiente de densidad y lo aplicó con éxito en la cirugía maxilofacial, aunque el gran inconveniente de esta técnica era la gran cantidad de sangre del paciente (400-450 mL) que se requería. Anitua dio un paso gigante al describir un método de preparación de plasma rico en plaquetas libre de leucocitos que requería de volumen pequeño de sangre y solo utilizó iones de calcio para la activación de las plaquetas. Este PRP, conocido hoy en día como el plasma rico en factores de crecimiento (PRGF), ha sido aplicado con éxito en el primer ensayo clínico del uso de concentrados plaquetarios en la preservación del reborde alveolar. La tecnología del PRGF se está utilizando actualmente para el tratamiento de diversas patologías de diferentes áreas de la medicina como la odontología e implantología oral, ortopedia, medicina del deporte y dermatología, entre otros, para promover la curación de heridas y la regeneración de tejidos. La aplicación de las diferentes formulaciones que se obtienen mediante la tecnología del PRGF es directa por parte del especialista en la zona a tratar del paciente. Dicho tratamiento puede ser ambulatorio o quirúrgico dependiendo de la patología a tratar. Sin embargo, en el caso del tratamiento de patologías oftálmicas, la mayoría de los trastornos de la superficie ocular son enfermedades crónicas que deben tratarse durante mucho tiempo para lograr resultados satisfactorios. Asimismo, es el propio paciente quien diariamente tiene que aplicarse el tratamiento ya que es necesaria su aplicación en forma de colirio entre 2 y 8 veces al día. Por lo tanto, las terapias utilizadas para el manejo de estas enfermedades deben mantener su funcionalidad y estabilidad durante varios meses para ser utilizadas diariamente a lo largo de este tiempo. Así, esta Tesis Doctoral fue desarrollada para dar respuesta a esta necesidad clínica de aplicar el potencial regenerativo del plasma rico en factores de crecimiento (PRGF) en una formulación segura y eficaz que se podría aplicar por el paciente en su casa. Para ello fue necesario desarrollar 5 trabajos de investigación que resultaron en 5 publicación científicas que forman esta Tesis. El primer trabajo fue necesario para diseccionar el origen de la inmunotrombosis que articula los primeros instantes de la reparación tisular. Fruto de esta revisión, se ha descrito que el elemento tractor de la evolución fue la supervivencia mediante la restauración de la homeostasis y la reconstitución de los tejidos. Esta revisión también contextualizó tanto los aspectos universales de la reparación tisular como el uso terapéutico del plasma rico en plaquetas como enfoque de la biología como estrategia terapéutica en el contexto de los cambios evolutivos de la coagulación y la hemostasia. Así con este trabajo se ha sentado la base para explorar el efecto de la separación de la fibrina del PRGF en un formato de sobrenadante que sería apto para su uso como suplemento en los cultivos celulares o como colirio oftalmológico. En el segundo trabajo se ha realizado una revisión sistemática para averiguar tanto el método de preparación como los resultados del uso el uso de plasma humano rico en plaquetas (en formato de sobrenadante) como sustituto de los sueros xenogénicos en las terapias celulares. Fruto de esta revisión, se ha demostrado que el uso de plasma rico en plaquetas empobrecido en leucocitos (en formato de sobrenadante) es una alternativa factible a los sueros xenogénicos. Así, se ha reconfirmado la idoneidad del PRGF (libre de leucocitos) para ser la base del desarrollo de un colirio para aplicaciones oftalmológicas. En el tercer trabajo fue importante un estudio comparativo entre el colirio de suero autólogo (preparado desde la sangre) y el colirio PRGF para averiguar las diferencias entre las dos preparaciones. En este trabajo experimental se han preparado los dos tipos de colirio de cada donante y fueron añadido a cultivos celulares de los queratocitos del estroma corneal humano (HK). El análisis proteómico se llevó a cabo para analizar y caracterizar los perfiles proteicos diferenciales entre el PRGF y el suero autólogo, y las proteínas expresadas diferencialmente en las células HK. Los resultados obtenidos muestran que el suero autólogo sin diluir induce la activación de diferentes vías relacionadas con una respuesta inflamatoria, angiogénica, de estrés oxidativo y de cicatrización en las células HK respecto al PRGF. Estos resultados sugieren que el PRGF podría ser una mejor alternativa que el suero autólogo para el tratamiento de la superficie ocular. En los siguientes dos trabajos se ha estudiado experimentalmente los diferentes métodos para la conservación del colirio PRGF. Los métodos de conservación ensayados fueron la liofilización y/o la conservación en frío. Así, en el cuatro trabajo, el colirio PRGF fue liofilizado solo o en combinación con un lioprotector (trehalosa), y luego se almacenaron las muestras durante 3 meses a temperatura ambiente o a 4°C. Se analizaron varios factores de crecimiento en cada tiempo y condición de almacenamiento. Además, se evaluó el potencial proliferativo y migratorio de los colirios liofilizados ricos en factores de crecimiento conservados durante 3 meses a diferentes condiciones de temperatura en queratocitos humanos primarios. Los resultados indicaron que el colirio liofilizado del PRGF ha conservado los principales factores de crecimiento y su actividad biológica tras su almacenamiento a temperatura ambiente o a 4°C durante los 3 meses del ensayo. Por lo tanto, el colirio liofilizado del PRGF conserva sus características biológicas incluso sin el uso de lioprotectores durante al menos 3 meses. En el quinto trabajo, el objetivo fue analizar si los colirios del PRGF conservan su actividad y sus propiedades biológicas después de su almacenamiento durante 9 y 12 meses a -20°C, y a 4°C, y a temperatura ambiente (TA) durante 3 y 7 días en comparación con las muestras frescas (t0). Los resultados indicaron la estabilidad biológica del colirio PRGF en todas las condiciones ensayadas. Todos los niveles de los principales factores de crecimiento se conservaron en cada tiempo y condición de almacenamiento. No se observaron diferencias en la proliferación de queratocitos humanos tras el tratamiento con el colirio del PRGF en ninguno de los tiempos o temperaturas estudiados. No se observó contaminación microbiana en ninguno de los colirios del PRGF. Así, el colirio del PRGF puede almacenarse hasta 12 meses sin que se reduzcan los principales factores de crecimiento y proteínas y sin que se produzca ninguna contaminación microbiana. Además, la actividad biológica del colirio del PRGF se mantiene después de almacenarlas durante 3 y 7 días a 4°C o a temperatura ambiente. Estos resultados fueron confirmados en el sexto artículo dónde se ha realizado un estudio proteómico para ver el efecto de la liofilización del colirio del PRGF en la composición proteica del colirio y en las expresión de proteínas por queratocitos del estroma corneal humano (HK). Los resultados mostraron que se han detectado 280 proteínas, y sólo 8 de ellas alcanzaron diferencias significativas entre las dos formulaciones. Además, 101 de las 3213 proteínas detectadas en las células HK mostraron una desregulación estadísticamente significativa tras el tratamiento con PRGF o PRGF lyo. El análisis de ontología génica mostró que estas proteínas desreguladas estaban implicadas en 30 procesos funcionales. Sin embargo, el Ingenuity Pathway mostró que no se encontraron diferencias significativas en ninguno de los procesos identificados. Por lo tanto, el presente estudio muestra que no se encontraron diferencias significativas en el perfil proteómico o en la activación de vías de señalización en células HK entre PRGF y PRGF lyo La presente investigación ha puesto de manifiesto la posibilidad de deferir la preparación del PRGF de su aplicación clínica. Ofreciendo la posibilidad de una aplicación crónica y repetida del PRGF, que ha sido preparado a partir de una única extracción de sangre. El hecho de que el colirio del PRGF no tiene fibrina abre el camino hacía su uso en otras áreas de la medicina, como por ejemplo la reproducción asistida dónde el tiempo entre la aplicación del PRGF y la transferencia del embrión es inferior al tiempo de la degradación de la fibrina. Así el uso del colirio del PRGF podría ser ventajoso para no interferir con la implantación del embrión en el endometrio. Esta investigación es una prueba como el hecho de simplificar la formulación del PRGF ha abierto el camino para optimizar la reparación en oftalmología y otras aplicaciones que quedan por descubrir.