Tecnología lamp para el diagnóstico molecular adaptado de enfermedades infecciosas

Resumen

Históricamente, el progreso en el diagnóstico de enfermedades infecciosas se ha visto limitado por los requerimientos técnicos y estructurales que presentan muchas de las metodologías utilizadas. Así, tecnologías con elevada sensibilidad y especificidad, como la amplificación de ácidos nucleicos, han quedado restringidas a laboratorios de referencia con importantes infraestructuras. Por ello, infecciones endémicas en países en vías de desarrollo son las que más han sufrido este problema diagnóstico. La carencia de sistemas apropiados para la detección de patógenos ha llevado en muchas ocasiones a un sobre o infra tratamiento, a una falta de este e incluso a un tratamiento innecesario o hasta dañino. Ha resultado también en una distorsión de los datos epidemiológicos de numerosas enfermedades infecciosas. Las técnicas de amplificación isotérmica de ácidos nucleicos se desarrollaron con la promesa de llevar al campo el diagnóstico molecular realizado en el laboratorio. La amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP, del inglés Loop-mediated isothermal amplification) es hoy día la más utilizada entre todas ellas. Sin embargo, tras dos décadas desde su presentación, éste y otros métodos isotérmicos siguen siendo infrecuentes en la práctica clínica diaria. En este contexto, nos planteamos como hipótesis de esta Tesis Doctoral la necesidad de adaptar esta tecnología y combinarla con otras que permitan almacenar y transportar los reactivos de reacción necesarios, sin requerir una cadena de frío. También consideramos preciso disponer de dispositivos pequeños, portátiles y autónomos para llevar a cabo la reacción. Además, la amplificación convendría poder monitorizarla a tiempo real y todos los datos generados ser gestionados cómodamente a través de un dispositivo inteligente. Esta hipótesis se basó en un análisis bibliográfico detallado que se presenta como introducción. En primer lugar, se definen las generalidades de los diferentes diagnósticos basados en ácidos nucleicos, desde la PCR hasta las distintas técnicas de amplificación isotérmica y los diferentes análisis post-amplificación. Una vez establecido este marco teórico, se describen en profundidad las aplicaciones de la tecnología LAMP en las enfermedades tropicales desatendidas (NTDs, del inglés Neglected Tropical Diseases), con especial atención a la esquistosomosis y en la infección por SARS-CoV-2. En estas revisiones se destacan las fortalezas de los estudios presentados hasta la fecha y también sus limitaciones. Se establece así una hoja de ruta para las aportaciones que este trabajo de investigación puede hacer al campo de estudio. De esta manera, propusimos como objetivo general la adaptación de la tecnología LAMP para su validación como método molecular en el diagnóstico de las enfermedades infecciosas. Para ello, se definen diversos objetivos específicos que se van alcanzando en los diferentes artículos de investigación presentados en esta Tesis Doctoral. El primer objetivo específico se basaba en desarrollar y aplicar un método de estabilización sencillo que permitiera almacenar reactivos LAMP listos para el uso a temperatura ambiente. Para ello, utilizamos el método SmMIT-LAMP, previamente publicado por nuestro grupo para la detección de ADN de Schistosoma mansoni. Con un simple proceso de desecación, obtenemos reactivos listos para el uso y estables a temperatura ambiente durante varias semanas. Como segundo objetivo específico nos planteamos diseñar y desarrollar un dispositivo portátil y una aplicación móvil, con el fin de realizar reacciones a tiempo real de amplificación isotérmica y analizar y almacenar los resultados obtenidos. Este dispositivo se materializa en el SMART-LAMP, que fue registrado como modelo de utilidad concedido en la Oficina Española de Patentes y marcas bajo el título “Dispositivo de diagnóstico de enfermedades tropicales desatendidas”. Durante la realización de esta Tesis Doctoral, estalló la pandemia provocada por SARS-CoV-2. El desarrollo de métodos de diagnóstico rápidos, sensibles y precisos se convirtió en una tarea de imperiosa necesidad en los primeros compases de la misma. Por ello, establecimos como tercer objetivo específico el diseño de diferentes ensayos RT-LAMP (Reverse transcription–LAMP) para la detección del virus y su evaluación en diversas muestras clínicas. Describimos ocho ensayos RT-LAMP diferentes para la detección de SARS-CoV-2. Además, realizamos un análisis comparativo de estos en términos de cinética, sensibilidad y especificidad y finalmente seleccionamos los mejores para su posterior aplicación en muestras clínicas. Se observó una alta sensibilidad y especificidad en muestras de exudados nasofaríngeos. Sin embargo, se comprobó que no eran útiles en muestras de orina para la detección de ARN del virus. Por otra parte, se realizaron mejoras sobre el protocolo de estabilización de los reactivos, incrementándose a dos meses su estabilidad a temperatura ambiente. El cuarto objetivo específico tuvo como finalidad evaluar la utilidad diagnóstica del dispositivo portátil SMART-LAMP. Para ello, diseñamos un estudio piloto en el que combinamos el uso del dispositivo con el método de estabilización de reactivos desarrollado, obteniendo un sistema portátil y fácil de utilizar en zonas de escasa infraestructura. Se ensayó para la detección de Schistosoma mansoni, S. haematobium, Strongyloides spp. y SARS-CoV-2, obteniendo elevados valores predictivos. Los resultados fueron comparables con los obtenidos por RT-qPCR y con un dispositivo comercial de amplificación isotérmica. En conclusión, el trabajo que aquí se presenta muestra: (i) el desarrollo de una metodología sencilla y rápida de estabilización de reactivos LAMP, que permite su almacenamiento a temperatura ambiente en un formato listo para el uso; (ii) el diseño y desarrollo de un dispositivo portátil (SMART-LAMP) que permite la realización a tiempo real de reacciones de amplificación isotérmica, controlado a través de una aplicación móvil; (iii) la puesta a punto de un RT-LAMP para la detección de SARS-CoV-2 con altos valores de sensibilidad y especificidad; (iv) la aplicación del SMART-LAMP para diferentes ensayos LAMP, demostrando su excelente rendimiento diagnóstico, con resultados comparables a los obtenidos con técnicas moleculares de referencia (RT-qPCR) y otros dispositivos comerciales de amplificación isotérmica.