Characterization of the dendritic cell and monocyte-macrophage system through lifealterations in monoclonal gammopathies

Resumen

INTRODUCCIÓN Los monocitos (Mo) y los macrófagos (M), junto con las células dendríticas (CDs), forman parte del sistema mononuclear fagocítico, compuesto por células inmunes funcionalmente relacionadas entre sí ("fagocitos mononucleares"), que desempeñan un papel esencial como células presentadoras de antígenos (CPA) en la conexión entre la respuesta inmune innata y la adaptativa. Hoy se reconoce que tanto los Mo/M como las CDs están integradas por un número significativo de diversas subpoblaciones celulares, heterogéneas y con distintas funciones efectoras e inmunomoduladoras, que constituyen una red celular compleja capaz de integrar múltiples señales ambientales, generando inmunidad o tolerancia. Hasta la fecha se han identificado dos subpoblaciones mayoritarias de CDs humanas circulantes en sangre: las CDs plasmocitoides (CDp) y las CDs convencionales (CDc), también conocidas como CDs mieloides (CDm). Del mismo modo, se han descrito diversas subpoblaciones de Mo con perfiles fenotípicos y funciones diferentes en sangre humana, y que incluyen los Mo clásico (cMo), intermedios (iMo) y no clásicos (ncMo). Aunque nuestro conocimiento sobre las CDs y los Mo ha aumentado considerablemente en los últimos años, todavía seguimos sin comprender completamente la posible relación madurativa que pueda existir entre las distintas poblaciones de CDs y de Mo detectables en sangre y otros tejidos, y las diferencias funcionales existentes entre ellas. Además, no disponemos de información acerca de la distribución de las diferentes subpoblaciones de Mo y CDs (y de sus fenotipos) en sangre a lo largo de la vida, desde el nacimiento a la vejez. La definición de los rangos normales de referencia de Mo y CDs en sangre, asociados a la edad, constituye una pieza de información esencial para poder identificar sus alteraciones y la naturaleza de las mismas en distintas enfermedades de base inmunológica, neoplásica o de otra índole. En este sentido, actualmente disponemos de información limitada disponible sobre la distribución de las diferentes poblaciones de Mo y CDs en sangre y médula ósea (MO) de sujetos sanos, así como en diferentes situaciones patológicas, incluidas aquellas en las que se ha referido que estas células inmunológicas desempeñan un papel relevante, como ocurre en las neoplasias de células plasmáticas (CP). Las neoplasias de CP son un grupo heterogéneo de trastornos neoplásicos con diferentes niveles de infiltración de la MO, sangre y/o otros tejidos por CP tumorales, asociadas a un comportamiento clínico variable, que incluyen la gammapatía monoclonal de significado incierto (GMSI), el mieloma múltiple quiescente (MMQ) y el MM activo; se ha visto que en estas enfermedades las células del sistema inmune innato, como los Mo/M y las CDs, desempeñan un papel importante en el crecimiento de las células tumorales, su plasticidad y los mecanismos de escape del tumor de la vigilancia inmunológica. El conocimiento preciso de las alteraciones específicas de las diferentes poblaciones de Mo de sangre y MO de pacientes diagnosticados de GMSI, MMQ y MM, y la posible relación existente entre estas alteraciones y otros marcadores séricos relacionados con el entorno tumoral y el sistema inmunológico, podrían contribuir a una mejor comprensión de las diferencias clínicas y biológicas observadas entre los pacientes con diferentes subtipos diagnósticos de neoplasias de CP. OBJETIVOS Partiendo de lo anteriormente expuesto, en esta tesis doctoral nos propusimos como objetivo general, investigar en mayor profundidad el fenotipo de las CDs y Mo humanos y la cinética a lo largo de la vida de sus diferentes poblaciones en sangre respecto a MO, ganglio linfático y bazo, con el fin de poder identificar mejor sus alteraciones en pacientes con diferentes neoplasias de CP (i.e., GMSI, MMQ y MM). Para lograr este objetivo general, abordamos tres objetivos específicos: 1. Analizar en detalle el fenotipo de diferentes poblaciones de CDs y Mo humanos circulantes en sangre, empleando un amplio panel de (nuevos) anticuerpos monoclonales sometidos a evaluación por parte del 'Tenth Human Leucocyte Differentiation Antigen Workshop en la sección de CDs (HLDA10-DC task)'. 2. Investigar la distribución de diferentes poblaciones de Mo circulantes en sangre a lo largo de la vida, desde el cordón umbilical y el recién nacido hasta la edad adulta y los ancianos, con el fin de establecer rangos de referencia normales de acuerdo con la edad y el sexo, y comprender mejor la relación existente entre los compartimentos celulares de Mo circulantes en sangre y los Mo/M presentes en MO, ganglio linfático y bazo. 3. Identificar alteraciones en la distribución y fenotipo de las diferentes poblaciones de Mo presentes en la MO y la sangre periférica (SP) de pacientes con distintas categorías diagnósticas de neoplasias de CP (i.e., GMSI, MMQ y MM), y su posible contribución, junto a un amplio panel de citocinas séricas y de otros marcadores óseos, para definir distintos perfiles de alteración de la interacción entre la CP neoplásica, el sistema inmune, y el metabolismo óseo, en cada entidad diagnóstica estudiada. MATERIAL, MÉTODOS Y RESULTADOS Características fenotípicas de las células dendríticas y monocitos en sangre humana Si bien en los últimos años hemos avanzado considerablemente en la comprensión del papel funcional de las diferentes poblaciones de CDs y de Mo, también se ha puesto de manifiesto que hay una gran heterogeneidad dentro de ambos compartimientos de CPA; por tanto se requieren estudios adicionales para poder definir mejor su función. En este trabajo realizamos una caracterización inmunofenotípica detallada del compartimento de CPA (CDs y Mo) circulantes; para ello, estudiamos muestras de SP de cinco adultos (voluntarios) sanos mediante citometría de flujo de ocho colores, empleando un panel amplio de 72 anticuerpos monoclonales, clasificados globalmente en siete nuevos clusters de diferenciación (CD), siguiendo las recomendaciones del 10th Human Leucocyte Differentiation Antigen Workshop (sección de CDs). Nuestros resultados mostraron que las CDp constituían la única población de CPA de SP que expresaba CD85g y CD195, mientras que carecían del resto de las moléculas investigadas. Por el contrario, las CDm expresaban receptores inhibidores de lectinas de tipo C y otras moléculas asociadas a respuestas inhibidoras, mientras que los Mo expresaban tanto receptores inhibidores como activadores de lectinas de tipo C, junto con otros receptores asociados a fagocitosis. En general, en los Mo de SP se observaron niveles de expresión progresivamente inferiores de los marcadores explorados, desde los cMo hasta los ncMo Slan y Slan+, excepto para el receptor endocítico CD368, presente de forma exclusiva en los cMo, junto con los receptores moduladores/señalizadores CD369 y CD371. Asimismo, la molécula (inhibidora) CD101 se expresaba de forma más intensa en los ncMo Slan+, respecto a los ncMo Slan. En resumen, nuestros resultados muestran que el patrón de expresión de las diferentes moléculas señalizadoras y receptores analizados en este trabajo, varía en las diferentes poblaciones de CPA de SP, aunque con perfiles de expresión similares para aquellas moléculas incluidas dentro de un mismo grupo funcional. Estos hallazgos sugieren que cada población de CPA tendría capacidad de reconocer patrones moleculares diferentes, y por tanto de generar distintas señales en respuesta a cada patrón molecular y, en consecuencia, tendrían un papel funcional distinto entre ellas. Distribución de distintas poblaciones de monocitos en sangre a lo largo de la vida Los Mo presentes en SP constituyen una población heterogénea de células que incluyen, entre otras, los cMo CD14hi CD16-, los iMo CD14hi CD16+ y los ncMo CD14-/lo CD16+. Aunque en los últimos años se ha incrementado la información existente en la bibliografía sobre los distintos compartimentos de Mo normales en sangre, seguimos sin disponer de datos fiables acerca de su cinética a lo largo de la vida, y su relación con las células del sistema Mo/M de MO o de los órganos linfoides secundarios. Por ello, en el presente trabajo nos planteamos analizar mediante citometría de flujo la distribución de las distintas poblaciones de Mo en sangre humana, a lo largo de la vida, desde la sangre de cordón umbilical y el recién nacido hasta la edad adulta y los ancianos (n=188), comparándola con la observada en diferentes tejidos linfoides de individuos adultos sanos, incluyendo MO (n=9), ganglio linfático (n=11) y bazo (n=11). En conjunto, identificamos 6 poblaciones de Mo en SP normal, cuya distribución variaba de manera significativa a lo largo de la vida, especialmente durante los primeros 6 meses tras el nacimiento. En concreto, los cMo alcanzaban su pico en sangre de cordón umbilical, mientras que los números más elevados de iMo y ncMo se observaban en recién nacidos, disminuyendo sus cifras posteriormente durante la infancia y la edad adulta hasta los 50 años. Cabe destacar que todas las (seis) poblaciones de Mo identificadas estaban presentes de forma sistemática, aunque en número variable, en todos los tejidos analizados, excepto en el ganglio linfático, donde los cMo Fc RI+ y los ncMo Slan+ estaban prácticamente ausentes. En general, encontramos cifras significativamente inferiores de cMo CD62L+ en el ganglio linfático y en el bazo, en comparación con la MO (p<0.01) y la SP (<0.01), a expensas de un porcentaje más elevado de iMo; por el contrario, los ncMo estaban especialmente más representados en la sangre y en el bazo. En resumen, nuestros resultados muestran que la cantidad de Mo normales circulantes en sangre y sus distintas subpoblaciones varía significativamente a lo largo de la vida, y en este sentido constituyen un marco de referencia de la normalidad (por rango de edad) para la identificación de perfiles potencialmente alterados en distintas enfermedades. La distribución diferencial de las diversas poblaciones de Mo en distintos tejidos linfoides podría contribuir a una mejor comprensión de su cinética y perfil de migración y maduración tisular en el organismo a lo largo de la vida. Perfiles de distribución de distintas poblaciones de monocitos en sangre y de marcadores inflamatorios y óseos en suero en pacientes con neoplasias de CP Estudios previos han demostrado la existencia de alteraciones significativas en los Mo/M de pacientes con distintos tipos de neoplasias de CP, como la GMSI, el MMQ y el MM sintomático, con un impacto en la alteración de la homeostasis normal del microambiente de la MO. En este trabajo analizamos la distribución de diferentes poblaciones de Mo en sangre y MO de pacientes recién diagnosticados de GMSI (n=23), MMQ (n=14) y MM (n=99), en comparación con la distribución en sangre y MO de donantes sanos (DS; n=107). En paralelo, cuantificamos los niveles en suero de un amplio panel de citocinas y biomarcadores asociados al metabolismo óseo. Nuestros resultados mostraron que mientras que en pacientes con GMSI existía una producción normal de (precursores) de Mo, incluyendo cMo, ambos estaban significativamente disminuidos en la MO de pacientes con MMQ y MM (p 0.02). Esto se traducía en recuentos significativamente más bajos de cMo CD62L+ recién producidos en la SP de los pacientes con MMQ (p=0.004), y de todas las subpoblaciones de cMo (CD62L+, CD62L- y Fc RI+) en los pacientes con MM (p 0.02). Por el contrario, en la MO de los sujetos con GMSI (p 0.03), MMQ (p 0.03) y MM (p 0.002) existía un incremento significativo de iMo y ncMo, si bien en la sangre ambas poblaciones de Mo estaban dentro de los límites de la normalidad (en la GMSI y en el MMQ) o disminuidos (en el MM; p=0.01). Paralelamente a estas alteraciones, observamos niveles séricos elevados de interleucina (IL)1ß en la GMSI (p=0.007) y en el MMQ (p=0.01), junto a concentraciones superiores de IL8 en el MMQ (p=0.01) y en el MM (p=0.002), así como niveles más elevados de IL6 (p=0.002), RANKL (p=0.01) y fosfatasa alcalina (FA) ósea (p=0.01) (asociado a un recuento disminuido de cMo Fc RI+) en los pacientes con MM que presentaban lesiones osteolíticas. En su conjunto, estas alteraciones se traducían en tres perfiles inmunes/óseos distintos: 1) normal, presente en DS y en la mayoría de las GMSI); 2) senescente, asociado a un aumento de IL1ß y/o IL8, presente en una minoría de las GMSI, la mayoría de los MMQ y algunos pacientes con MM sin lesión ósea; y 3) proinflamatorio, con niveles séricos elevados de IL6, RANKL y FA ósea y recuentos significativamente disminuidos de cMo Fc RI+ inmunomoduladores (p=0.01), característico de los pacientes con MM con lesión ósea asociada. Estos resultados aportan nuevos datos sobre la patogenia de las neoplasias de CP y el posible papel de los cMo Fc RI+ en la homeostasis del tejido óseo normal. CONCLUSIONES Con respecto al primer objetivo de este estudio, centrado en la caracterización detallada del inmunofenotipo de diferentes poblaciones de CDs y Mo de SP, basado en nuevos marcadores sometidos a la evaluación del '10th Human Leucocyte Differentiation Antigen Workshop en la sección de CDs (HLDA10-DC task)': 1. Las CDs de sangre, así como los cMo y los iMo, expresaban con mayor intensidad -respecto a las CDp y a los ncMo (especialmente los ncMo Slan+)-, tanto los receptores inhibidores tipo lectina C CD367 y CD371, como los receptores activadores tipo lectina C CD368, CD369 y CLEC5A. Estos hallazgos, junto con el patrón de expresión de (varios) marcadores mieloides y marcadores relacionados con la fagocitosis restringido a cMo e iMo, y en menor medida a ncMo, apoyan los hallazgos previos que indican que las funciones de presentación de antígenos y de fagocitosis están más relacionadas con las CDs y con los cMo e iMo, respectivamente, mientras que los ncMo podrían representar una etapa final de maduración de Mo más propensos a la apoptosis, de acuerdo también con su patrón de expresión del receptor purinérgico P2X7. 2. Ninguna de las poblaciones de CDs y Mo circulantes en sangre expresaba niveles detectables de la proteína CD365, mientras que CD366 se expresaba de forma intensa en las CDc y los Mo (pero no en las CDp normales), lo cual sugiere características más inmaduras, asociadas con un perfil de expresión de receptores inhibidores más marcado en las CDc y los Mo, respecto a las CDp. Con respecto al segundo objetivo de nuestro estudio, enfocado a determinar la distribución y el fenotipo de diferentes subpoblaciones de CDs y Mo normales en la SP a lo largo de la vida, e investigar la relación existente entre estas poblaciones de Mo de sangre y sus posibles contrapartidas de MO, ganglio linfático y bazo: 3. Los cMo alcanzaron sus cifras más elevadas en la sangre de cordón umbilical, mientras que el nivel más alto de iMo/ncMo se alcanzó en el recién nacido, con un claro predominio de los ncMo Slan- más inmaduros (vs. los ncMo Slan+ más diferenciados) hasta los 5 años de edad, disminuyendo posteriormente el número de estas células en sangre a lo largo de la infancia y la edad adulta. La diferente cinética observada para las distintas poblaciones de Mo de sangre podría reflejar una mayor necesidad de Mo en las etapas más tempranas de la vida, en las que habría que producir un número lo suficientemente elevado de estas células con la finalidad de 'llenar' los distintos tejidos del organismo en las etapas de mayor crecimiento; esto iría asociado a una representación en sangre cada vez mayor de las dos poblaciones de Mo más maduros, presumiblemente derivados de los tejidos en los que habrían llevado a cabo sus funciones. 4. Respecto a la sangre y la MO, tejidos en los que predominan los cMo CD62L+, en el ganglio linfático y en el bazo se observaron porcentajes significativamente inferiores de cMo CD62L+, a expensas de un mayor predominio de cMo CD62L- y de iMo. Estos hallazgos podrían reflejar la naturaleza más madura de los cMo presentes en los órganos linfoides secundarios respecto tanto a la SP como a la MO. Del mismo modo, la mayor proporción de iMo observada en el ganglio linfático y en el bazo (en comparación con la SP y la MO) podría ser también el reflejo de una mayor tasa de diferenciación de cMo hacia iMo en estos tejidos, lo cual apoyaría la hipótesis que sugiere que la maduración de cMo a iMo podría ocurrir de forma preferente fuera del torrente sanguíneo. 5. En términos generales, mientras que los ncMo Slan+ se encontraban altamente representados en sangre y bazo, ambas poblaciones estaban prácticamente ausentes en el ganglio linfático, y presentes en niveles mínimos en MO. En conjunto, estos resultados sugieren que los iMo generados en diferentes tejidos del organismo podrían migrar a través de los ganglios linfáticos a la sangre, donde generarían ncMo que podrían alojarse específicamente en el bazo, de acuerdo con las características preapoptóticas de esta población de Mo. 6. Los Mo de SP Fc RI+ mostraban un fenotipo de cMo CD14hi CD16- distinto y único, constituyendo una población minoritaria de Mo presente de forma sistemática tanto en sangre de cordón umbilical como en la SP de todos los individuos incluidos en este estudio; por el contrario, era una población celular indetectable en el ganglio linfático normal. Por el momento, seguimos sin conocer el posible significado e implicaciones funcionales de estos hallazgos. Con respecto al tercer objetivo específico de esta tesis doctoral, centrado en la identificación de los posibles patrones de alteración de las diferentes poblaciones de Mo en sangre y MO de pacientes con GMSI, MMQ y MM, y su relación con los perfiles séricos de marcadores inflamatorios y óseos: 7. Los pacientes con MMQ y MM presentaban niveles significativamente disminuidos de cMo CD62L+ y de cMo CD62L+, cMo CD62L- y de cMo Fc RI+, respectivamente. Además, a diferencia de lo observado en el MMQ y en el MM, en la GMSI encontramos porcentajes significativamente elevados de cMo en las muestras de MO. Globalmente, estos hallazgos podrían reflejar una mayor producción de cMo en la MO de pacientes con GMSI, con la finalidad de controlar el microambiente medular alterado en estos sujetos, seguido de una disminución de la producción y de la liberación a la sangre de cMo CD62L+ maduros desde la MO y de cMo CD62L+, CD62L-, y Fc RI+, en pacientes con MMQ y MM, respectivamente. 8. En términos generales, los pacientes con neoplasias de CP tenían cifras más elevadas en la MO de iMo y ncMo respecto a sujetos sanos, que apoyaría la existencia de una mayor tasa de migración de ncMo e iMo desde los tejidos a la sangre y de esta hacia la MO, asociado a un papel potencialmente relevante de ambas poblaciones de Mo en la fisiopatología del MMQ, MM y (en menor medida también) de la GMSI, como parte integrante de un microambiente medular alterado. 9. Paralelamente a las alteraciones numéricas anteriormente descritas, los Mo/M presentes en la SP y/o los tejidos linfoides de pacientes con diferentes categorías diagnósticas de neoplasias de CP parecen estar alterados también funcionalmente. En este sentido, observamos niveles séricos elevados (en comparación con los sujetos sanos) de IL-1ß, de IL-1ß e IL-8, y de IL-1ß, IL8, IL6 y los biomarcadores óseos RANKL, FA ósea y osteoprotegerina en la GMSI, el MMQ y el MM, respectivamente. Estos patrones nos han permitido definir tres grupos de pacientes cuya relevancia clínica requiere de estudios en series más amplias de pacientes: i) pacientes con GMSI y un perfil similar al de los sujetos sanos; ii) pacientes con MMQ o MM sin lesión ósea; y, finalmente, c) pacientes con MM que presentaban lesiones osteolíticas típicas.