Desarrollo de un modelo experimental de estrés oxidativo in vivo

Resumen

[ES]Los efectos nocivos de las especies reactivas de oxígeno (ROS) se producen durante la vida adulta , y se ha sugerido que el exceso de ROS- estrés oxidativo puede ser un factor que contribuye a los procesos neurodegenerativos . El glutatión ( GSH ) es uno de los más abundantes antioxidantes y , en enfermedades neurológicas tales como la enfermedad de Parkinson o trastornos mentales , la deficiencia de GSH es el conocido indicador bioquímico más temprana de degeneration.This neuronales observación ha llevado a la sugerencia de que el estrés oxidativo puede estar detrás de la causas de la disfunción neuronal asociada con estos trastornos neurológicos . Desafortunadamente , debido a la falta de una herramienta suficientemente robusto , el efecto específico de la deficiencia de GSH en la patogénesis de enfermedades neurológicas nunca se ha demostrado in vivo , por lo tanto el papel real de GSH estrés oxidativo pérdida mediada en estos trastornos sigue siendo difícil de alcanzar . El glutatión es un tripéptido ( g - glutamylcysteinilglycine ) sintetizado por dos reacciones dependientes de ATP consecutivos . El glutamato - cisteína ligasa ( GCL o sintetasa g - glutamilcisteína ; CE 6.3.2.2 ) cataliza la primera y limitante de la velocidad a paso , formando g - glutamilcisteína a partir del glutamato y cisteína . Esto es seguido por la glutatión sintetasa (CE 6.3.2.3 ) - reacción catalizada , que se une a G glicina - glutamilcisteína , la formación de glutatión . GCL es una enzima heterodimérica compuesta de un catalizador (pesado , 73 kDa ) y un modulador ( luz, 27,7 kDa ) subunidad . Estudios realizados con purificada GCL han demostrado que el sitio activo reside en la subunidad catalítica , mientras que la subunidad modulador aumenta la afinidad de la subunidad catalítica para el glutamato y disminuye la sensibilidad a la inhibición por retroalimentación por GSH . En el cerebro , donde - a lo mejor de nuestro , actividad GCL conocimiento - la enzima no ha sido purificada es muy débil , aunque es más alta en astrocitos en comparación con neurons.This contribuye a la mayor resistencia de los astrocitos , en comparación con las neuronas , contra el estrés oxidativo . Los astrocitos cooperan con las neuronas de la biosíntesis de GSH neuronal antioxidante mediante el suministro de los precursores de GSH . Por lo tanto , ya sea limitando el suministro de los precursores , o la capacidad de las neuronas para usarlos , provoca el estrés oxidativo en las neuronas que conducen a la neurodegeneración , por lo menos en la cultura . Esto nos ha llevado a la hipótesis de que desmontables neuronal específica y controlada temporalmente de GCL in vivo puede provocar una disfunción neurológica espontánea , lo que posiblemente imitando los problemas neurológicos asociados con el Parkinson o las enfermedades mentales y potencialmente útil para la identificación de proteínas redox-sensibles novedosos involucrado en trastornos neurológicos . Los modelos existentes in vivo para el estudio de GCL , subunidad catalítica , la deficiencia en el cerebro son escasos y fracasaron. Ratones knockout homocigotos contra GCL , subunidad catalítica , no son viables más allá del día 8 de embriones , y los heterocigotos presentan mecanismos de compensación como el aumento de la biosíntesis de ascorbato. Además , este sistema genético disponible no knockout tejido GCL específicamente o temporalmente controlada , siendo por tanto inadecuados para investigar el papel del estrés oxidativo en el sistema nervioso central durante la edad adulta . Nos habíamos identificado previamente una pequeña horquilla de ARN ( shRNA ) dirigido contra GCL , subunidad catalítica de que, en las neuronas cultivadas, desencadena el estrés oxidativo espontáneo. Hemos implementado estrategia de ARNi in vivo para producir un ratón de doble condicional que expresa la GCL shRNA en las células del sistema nervioso central , en particular las neuronas del hipocampo , para volver a crear el estrés oxidativo in vivo t tejido de manera específica y en inducible . Utilizamos la tecnología Cre - LoxP para crear ratones que expresan shGCL en las neuronas in vivo , y se caracterizaron bioquímicamente , inmuno - histológica y comportamiento. Se encontró una disminución en la GCL , y un aumento de los marcadores oxidativos . También encontramos efectos dependientes del sexo en la caracterización del comportamiento para las tareas de ansiedad , la capacidad motora y memoria. En conclusión , aquí se describe una estrategia novedosa para el estudio de estrés oxidativo in vivo de una manera específica y controlada en el tiempo el tejido . Este modelo puede abrir nuevas posibilidades para el estudio de la implicación de los elevados de ROS en las enfermedades mentales , como la enfermedad o la ansiedad de Alzheimer, que son intrínsecos a una serie de trastornos psiquiátricos como la depresión , ataques de pánico , fobias, trastorno obsesivo -compulsivo y el estrés postraumático , sin embargo , estas enfermedades carecen actualmente de apropiado en modelos in vivo para la investigación de nuevas estrategias terapéuticas. Además, puesto que hemos diseñado la herramienta genética con dos sitios de restricción únicos que flanquean la secuencia de ARNhc , nuevos modelos de ratones transgénicos podrían ser sencilla generada a desmontables cualquier otra proteína específica de tejido in vivo . Creemos que el modelo de ratón transgénico aquí descrito puede ser útil para una mejor comprensión de las consecuencias del estrés oxidativo en células específicas in vivo , así como para la evaluación de nuevos enfoques farmacológicos.