Complejidad y diversidad en los sistemas de transducción de señales en pseudomonas

Resumen

El conjunto de mecanismos encargados de captar señales ambientales para desencadenar las respuestas fisiológicas adecuadas, se denomina sistemas de transducción de señales clasificándose estos sistemas mayoritariamente en tres grupos: sistemas de un componente (OCS, del inglés one component system), sistemas de dos componentes (TCS, del inglés, two component system) y sistemas de señalización química. En esta tesis se han estudiado algunos sistemas de transducción de señales pertenecientes a los grupos TCS y sistemas de señalización química utilizando para ello, tres cepas distintas del género Pseudomonas. Con respecto a los TCS, se estudió el sistema TmoS/TmoT de P. mendocina KR1 para determinar el mecanismo de su funcionamiento. En este contexto, se realizó un estudio a nivel de secuencia, comparándolo con el TCS TodS/TodT de P. putida DOT-T1E. Este estudio pone de manifiesto que los aminoácidos implicados en la fosforilación y transfosforilación en cada uno de los dos componentes, permanecen muy conservados en ambos sistemas. Igualmente, el estudio de las secuencias promotoras así como de las secuencias implicadas en la unión al ADN del regulador de respuesta, presentan un elevado grado de similitud en ambos sistemas, lo que sugiere que el mecanismo de transducción de señal, es un mecanismo común en este tipo de TCS. Por otro lado, se llevó a cabo un estudio del perfil de ligandos de la Histidin Kinasa (HK) TmoS, para determinar qué ligandos son capaces de unirse a la HK, cuáles son capaces de inducir su autofosforilación, y cuáles de ellos producen la inducción del promotor PtmoX. Para ello, se realizaron estudios de Calorimetría Isoterma de Titulación (ITC, del inglés, Isotermal Titration Calorimetry) con un amplio rango de compuestos aromáticos, ensayos de actividad β-Galactosidasa así como ensayos de fosforilación usando ATP marcado con 32P. Los resultados obtenidos revelaron que TmoS es capaz de reconocer y unirse a un elevado rango de hidrocarburos aromáticos con elevada afinidad, sin embargo sólo algunos de estos compuestos son capaces de inducir la fosforilación de la HK y activar la transcripción de los genes implicados en la ruta de degradación, lo que sugiere que el reconocimiento de agonistas y antagonistas, es una característica común en esta familia de proteínas. Con respecto a los sistemas de señalización química, se emplearon dos cepas bacterianas distintas pertenecientes al género Pseudomonas: P. putida KT2440 y P. aeruginosa PAO1. En P. putida KT2440 existen tres parálogos de la metiltransferasa CheR. Para determinar que todos los parálogos son funcionales, y que todos ellos están sujetos a inhibición por S-adenosilhomocisteína (SAH), se realizaron ensayos de ITC. Por otro lado se ha determinado la función de dos de los tres parálogos de CheR descritos en esta cepa. Para ello, se construyeron mutantes en los genes que codifican para cada uno de los parálogos de CheR, y posteriormente, se procedió a la realización de distintos tipos de ensayos como ensayos de quimiotaxis, metilación, formación de biopelículas, o ensayos de motilidad mediante pilus tipo IV (twitching motility). Los resultados revelaron la implicación del parálogo CheR1 en una vía homóloga a la vía WSP, por lo que se concluyó que CheR1 es el único parálogo implicado en la formación de biopelículas. Con respecto al parálogo CheR2, se determinó que está implicado en procesos quimiotácticos. Sin embargo, ensayos realizados con CheR3 y su correspondiente mutante, no mostraron resultados concluyentes, de manera que este parálogo no pudo relacionarse con ninguna vía de señalización. Para determinar la especificidad de unión entre los distintos parálogos de CheR en P. aeruginosa PAO1 con los quimiorreceptores, se procedió al estudio de las secuencias de los 4 parálogos presentes en esta cepa, así como de los quimiorreceptores. Estos análisis revelaron la existencia de un pentapéptido C-terminal en 3 de los 26 quimiorreceptores de esta cepa, y la existencia de un tripéptido en el subdominio β del parálogo CheR2. Mediante estudios de mutagénesis dirigida, y mediante la realización de ensayos de interacción por ITC, y metilación, se determinó que únicamente el parálogo CheR2 es capaz de unir el pentapéptido del quimiorreceptor McpB. Por otro lado, se concluyó que tanto el pentapéptido del quimiorreceptor McpB, como el tripéptido GPN de CheR2, son esenciales para la unión de ambas proteínas y para la metilación eficaz del quimiorreceptor por parte de la metiltransferasa. La inserción del tripéptido GPN en el subdominio β de la metiltransferasa CheR2, determina la clasificación de las metiltransferasas en dos familias distintas, diferenciadas por su capacidad de unión a pentapéptidos C-terminales, pudiendo utilizar esta característica, como herramienta predictiva para identificar metiltransferasas del tipo CheR con capacidad de unir pentapéptidos. Por último, en esta tesis doctoral se desarrollaron distintos ensayos de bioseguridad con organismos tales como Caenorhabditis elegans, Eisenia foetida, Adalia bipunctata, Chrysoperla carnea o Daphia magna, entre otros, para determinar la posible relación del quimiorreceptor McpB del patógeno P. aeruginosa PAO1 con virulencia. Para ello, se construyó un mutante en el gen mcpB y se llevaron a cabo los citados bioensayos con la cepa silvestre y con el correspondiente mutante en el quimiorreceptor. Los resultados obtenidos demostraron, que en aquellos ensayos que suponen un contacto directo del organismo con el patógeno, como pueden ser aquellos en los que se suministró la bacteria como parte de la dieta, se observó una relación directa entre McpB con procesos de virulencia. Sin embargo, en aquellos ensayos que suponen un contacto con las sustancias expulsadas al medio por ambas cepas, no se observaron diferencias significativas entre la cepa silvestre y el mutante. Estos resultados sugieren que McpB está implicado en alguna vía relacionada con la virulencia de la cepa, aunque los mecanismos moleculares de esta vía, aún no se conocen.